Summary
ここで収穫を生産するためのプロトコルを説明ドナーを引き起こすことがなく全層皮膚組織を収集するために使用することができます針サイト瘢痕します。針は、大量収穫を達成するために単純なコレクション システムと組み合わせることができます。
Abstract
本稿では、全層皮膚組織の配向柱状を収集するために使用できる既製の部品から作られた実験室の装置の製造プロセスについて説明します。配向柱状の小型サイズにより、ドナーをドナーサイト全層組織可能含め皮膚組織の細胞細胞外構成要素の混入を収穫しながら瘢痕化を引き起こすことがなく、迅速に回復サイト皮膚の深部、皮膚付属器の構造と正常に再現従来のティッシュ エンジニア リング技術を使用してまだあります。癒し、強化するために皮の傷に直接適用できる、配向柱状または彼らは他の組織工学的アプローチの自家細胞・組織のソースとして使用することができます。収穫の針が標準的な注射器の針を変更することによって作られています、少量の組織を採取するためだけに使用したりの吸引ベースの単純なコレクション システム (一般的な実験室の供給から作られて) と相まって大量収穫大動物モデルでの研究を容易にします。
Introduction
自家皮膚移植は傷の修復の主力が、ドナー サイト希少性と従来の皮膚移植1,2 を交換する新たな治療選択肢を開発するここ数十年の努力につながる罹患率による制限.我々 は最近収穫ドナー サイト罹患率を最小限に抑えながら全層皮膚移植の利点を活用する皮膚の代替方法を開発しました。小 (~0.5 mm 径)「配向柱状」の形で全層皮膚を集めることによってドナーのサイトは急速に、通常の状況下で瘢痕化せずに治癒することができる (潜在的な例外を除いて、以下の説明を参照してください)3。配向柱状傷傷の閉鎖を加速、収縮3を軽減するベッドに直接適用することができ、表皮及び真皮の細胞の種類と機能の付属器の構造4に欠けている多くの多様な範囲を復元従来の分層皮膚移植または現在遺伝子組み換え皮膚代替5。ヒーリングを強化するために配向柱状の瘢痕化せずに治癒するドナー サイトの機能が両方独立してによって検証されていない他の研究グループ6,7。
我々 は以前スケール8; 配向柱状のコレクションを有効にする研究室収穫システムを開発しました。ただし、このシステムは広く利用可能ではない多くのカスタマイズされたコンポーネントの構成されます。ここでは、プロセスを説明詳細に大量収穫を達成するために使用することができますほとんど既製のコンポーネントから作られた単純なコレクション システムと同様に、針、収穫の生産のため。本稿に記載されている装置に適しての in vitroおよび動物の仕事は人間の使用できません。人間にこの手法を適用するため FDA の認可の臨床デバイスは市販されているが、詳細はここでは説明しません。
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Protocol
すべての作業を含む生きた動物と動物の組織サンプルは、マサチューセッツ総合病院制度動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) によって承認されています。
1. 針を収穫の生産
- 生産段階のセットアップ
- ポストに女性ルアー ロック コネクタを固定し、ルアーロックがセンター ステージ (図 1A) のように、回転ステージの上にポストをマウントします。
- この最初の回転ステージを垂直方向に配置し、(図 1B) 第二に、水平回転ステージの上に垂直にマウントします。
- 2 軸の平行移動ステージ (図 1B) に水平回転ステージをマウントします。
- 光学ブレッド ボードなどの安定した表面上に組み合わせを固定します。
- ブレッド ボードおよびルアーロック ロック コネクタとほぼ同じ高さで同時に回転/翻訳組み合わせステージ (図 1C) に配置されているツールを使って同じブレッド ボード上にロータリー ツールを個別にマウントします。
- ロータリー ツール (より大きくより高い粒石カットオフ ホイールをより小さい、低粒ダイヤモンド カットオフ ホイール) の上に同心円状の 2 つのカットオフ ホイールを組み込んで (図 1D)。
注: 約 9 mm 2 つの車輪の直径の違いは通常十分です。 - 頭上からライトが切断砥石を目指した光と回転工具で調節可能な腕を持つソースの位置。
- 可視化を高めるためには、接眼レンズは切削のホイール (図 1C) に焦点を当てたので、解剖顕微鏡を生産の設定上に置きます。
注: また、ユーザーことができますメガネを着用拡大鏡。
- 針の先端を再編
- 保護メガネや金属の微粒子が目や気道に入るを防ぐためにサージカル マスクを着用します。
- 適切な注射針ゲージ実験的要件に基づいて、サイズを選択します。
- 各収穫の針を目的の長さをオフにマークします。
注: 豚皮から収穫するため、8 mm 針は通常十分であるか、します。長さが異なる場合がありますが、実験のニーズに基づいて (e.g。、ターゲット皮膚組織、針ゲージ サイズの厚さ)。一般に、19 ゲージの針は豚皮に適しています。 - 低く、パワーと回転工具に垂直に針針の余分な長さをカットする外側切削ディスクのエッジを使用して時点でマーク ステップ 1.2.3。
- 生産段階の短縮、鈍針を女性ルアー ロック コネクタに接続します。
- (角度は針を挿入するために必要な力に影響を与える変更する) 回転工具の切削のホイールに平行 12 ° の角度で針が水平回転ステージを調整します。
- 天井の照明をオンし、光で針の正中線 (縦) 反射まで倍率の下に針を観察しながらその位置を調整します。
- 切断ディスク (図 2A) インナー (ダイヤモンド) に向かって針を事前にロータリー ツール、翻訳段階の使用の電源を入れます。
- 切削ディスク約 (正中線に沿って頭上の光の反射による可視化) 針の正中線に達するまで切削ディスクに対してゆっくりと針を進めて維持します。
- ゆっくりと細かいポーランド (図 2B) でカット針表面に外の石の輪に内部のダイヤモンド ホイールから針のカット面を移動します。
- 切削ディスクから針を撤回します。
- 垂直方向の回転ステージを使用して、針を 180 ° 回転します。
- 手順 1.2.9-1.2.10 針の反対側の形状を変更するを繰り返します。
注意: 針には (図 2および2 D) ほぼ等しい長さの 2 つの切削ヒントがはずです。 - 生産段階から針を抜きます。
- きれいな内側ボアは針の内径よりわずかに小さい金属線。
- シャープな木の棒を使用して (e.g。、綿の先端アプリケータの小さな木製の棒の端にスナップすることによって)、新しく形成された針の端にまだ接続されている可能性があります任意のバリを除去します。
注: 収穫針電解研磨をすることができます、必要に応じてオートクレーブで滅菌します。
2. 皮膚組織採取
- 前のヴィヴォ組織または生きている動物から皮膚配向柱状を収集するのに収穫の針を使用します。
- 前のヴィヴォ肌 (特にから皮下脂肪がないか、先にトリミングされたサンプル)、薄い組織 50 mL 遠心管の開口部に標的組織を保持または n を損傷を避けるため、お互いの上に組織の 2 つのスタックハード面に対してそれらを打つことによって eedle のヒント。
注:生体内で生きている動物から収穫のためは、リドカイン ・ エピネフリンが無痛の出血を減らすために皮内注射によって管理されることをお勧めします。 - 下記のとおり必要な配向柱状の量に応じて収穫装置を組み立てます。
- 低-中程度のボリュームのオプション:
- 中量配向柱状に小さな収穫、単に標準的なシリンジを記入 (10-20 mL 注射器は通常うまく) 通常生理食塩水で、収穫の針に接続します。
- 完全にドナー皮膚に収穫の針を挿入し、それを撤回します。
- 収穫の針を通して生理食塩水のフラッシュが針穴に詰まってマイクロカラムを追放し注射器のピストンを押してください。
- 収穫のプロセスをスピードアップするためステップ 2.4.3 で配向柱状を追放する前に 3 〜 5 回 2.4.2 のステップを繰り返します。
注: 通常スタンダード セル ストレーナー配向柱状の後のコレクションを容易にするために、配向柱状を追放すると便利です。 - 針の詰まりになる場合は、スタックの組織を追放し、詰まりを削除するピストンの圧力を高めます。単に圧力の増加に十分な場合挿入針の詰まりをクリアする針の先端の開口部を通して金属ワイヤを産んだ。
- 乾燥を防ぐために、までに沈んで配向柱状生理食塩水または中規模を保ちます。
注: 経験豊富な演算子のある上記の方法は 1 秒あたり約 1 マイクロ コラムのレートで配向柱状の収穫に使用できます。
- 高ボリュームのオプション:
- 配向柱状の大量のコレクションを容易に構築することができますシンプルな吸引アシスト デバイスを作成します。
注: デバイスは、収穫の針、ルアー ロック ノズル、通常脂肪吸引 (図 3A)、滅菌吸引容器用吸引アダプター付き 20 mL 注射器で構成されています。 - 20 mL の注射器のプランジャーを取り外します。
- 注射器を吸引アダプターに接続します。
- 収穫針を注射器 (図 3B) にアタッチすることにより、組立は完了します。
- 滅菌吸引チューブの部分を使用して滅菌吸引容器に吸引アダプターを接続します。収穫装置が開けたりキャニスター (これは流出ではなく、流入のためマークされているキャニスター ポートへの接続を要求するかもしれない) に流入する流体ができるキャニスター入力に接続されていることを確認します。
- 否定的な圧力源装置に接続します。
注: 必要な圧力は、前述の8として針の直径と長さに依存します。本稿に記載されている装置、吸引システムで、一般的な手術室は、一般に十分です。 - 収穫の針を注射器に接続します。
- 収穫の針を皮膚に挿入することで、配向柱状を収穫します。
注: 配向柱状が注射器に吸引、描き下ろしを吸引容器にフラッシュされます。 - 断続的にシステムをフラッシュする収穫の手順中に滅菌生理食塩水の容器に収穫の針をつけます。
注: この生理食塩水のフラッシュ、マイクロカラムの輸送を容易に、確実に彼らは水和滞在します。また、ルアーロック シリンジと接続チューブ、壁掛けの生理食塩水点滴バッグにもに MFF ルアーロック アダプターを接続できます。 - 一方金属ワイヤーを保持またはより小さいゲージの針、収穫の針の内径よりわずかに小さいが。針が目詰まりした場合は、針穴に金属線を挿入することによってクリアできます。
- 配向柱状の希望の金額は、キャニスターに蓄積したとき吸引からデバイスを切断し、配向柱状を収集するフィルターを通してうち吸引容器の中身を注ぐ。
- 配向柱状の大量のコレクションを容易に構築することができますシンプルな吸引アシスト デバイスを作成します。
- 収穫後に、ドナーのサイト上局所用抗生物質軟膏を適用します。
注: 追加のドレッシングは一般的に不要ドナーのサイトです。
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Representative Results
収穫の針は約 80-90% の成功率、全層皮膚組織の配向柱状を収集することができるはずし、各マイクロカラムは表皮、真皮、およびいくつかの皮下脂肪 (図 4) を含める必要があります。収穫の成功率が低く、組織に針を挿入することは困難となる場合や、新しい針が必要可能性があります。収穫の成功率は一貫して低く、新しい針も、もし針が短すぎるおそらくです。
生体内で使用する場合ドナー サイトを再上皮化は通常いくつかの日3の内で発生するとすぐに、癒す必要があります。配向柱状は創傷治癒の3、4を強化するためにベッドを傷に直接適用することができます。 または組み合わせ構造を生成する異なるマトリクス材料と組み合わせることがあります。配向柱状は、培養研究9の文化も維持できます。
図 1: 針装置を作成します。(A) 男性ルアー ロック コネクタ、ルアーロックがステージのセンターにくるように縦に配置された回転ステージの上に取り付けポストを介して保護します。(B) 垂直方向の回転ステージが 2 番目、水平回転ステージ (黒矢印) に垂直にマウントされています。水平回転ステージは、2 軸の平行移動ステージ (白い矢印) に固定されています。(C) (白い矢印)、ブレッド ボードと針打ち装置 (赤矢印) に解剖顕微鏡と平行回転工具の位置決め。(D) 同心カットオフ ホイール マウント内側にダイヤモンド ホイールの回転工具 (黒い矢印) と外側の石の輪 (白い矢印)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 針を希望の長さに切断、新しい針の先端を挽くにロータリー ツールが使用されます。(A) まず、ダイヤモンド カッターは切断の新しいヒントと表面を形成する「ラフ」の切口を作るためです。(B)、ダイヤモンド砥石による切断の新しいヒントを形成後、針は精密研磨の石の輪に移動されます。(C) 側からフロントと (D) から見た針を収穫完了。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 大量収穫のアセンブリです。(A) 個々 の (左右から) を含むアセンブリ コンポーネント ルアーロック ロック ノズルと収穫針 20 mL シリンジ、吸引アダプター。(B) 表示は、完成したアセンブリ、負圧のソースに接続する準備ができてです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 本稿で説明する装置を使用して収穫される代表的な皮膚配向柱状。各マイクロカラムには表皮 (1)、完全真皮 (2) と一部の皮下脂肪 (3) が含まれています。図のチェック マークは、1 mm を表しています。この図は、Tamらから変更されています。4対応するクリエイティブ ・ コモンズ ・ ライセンスの条件に従って。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する方法は、生体内で大きな動物研究のため市販の実験室の供給から作られたツールを使用して十分な量の組織配向柱状のコレクションを有効にするものです。この装置は、生きている豚皮3と同様に摘出ひと皮膚4,9から組織を収穫で以前使用されています。記載されている特定のパラメーターは、豚での使用に最も適していることがわかった。同じ装置を変更および齧歯動物および他の小さい動物から組織を収集するために適応することができますが、これは私たちの研究室でテストされていませんが期待されます。
このプロトコルの重要なステップは、収穫の針 (非効率的な収穫は通常針短すぎるため) 十分な長さを確保するを防ぐために収穫のプロセスを通して液体に浸漬、配向柱状を維持乾燥と断続的に、少なくとも生理食塩水でシステムをフラッシュ (それ以外の場合は配向柱状の針穴の目詰まりの可能性が高い)。この手法の主な制限は速度;たとえば、私たちのデモで吸引アシスト装置は、毎分、小さい傷サイズ通常動物実験で使用のために十分である組織の 120 mg を一般的に収穫できます。ロジスティック困難である非常に大きい傷にこのアプローチを使用することは可能性が高い (e.g。、主要な傷害モデルを書き込む)。針のゲージは別の制限 - 針のゲージが小さいより影響を受けやすいそれは、座屈にこの手法の主な故障モードである (対照的に、テクニックはない針のプロシージャの間に鈍くなるに比較的敏感)。豚皮のため我々 は通常 19 ゲージの針は、機械的に十分な堅牢です彼らはほとんどバックルを使用します。さらに、各動物実験 (を含む通常 3,000-5,000 配向柱状) 通常のみ 2 に 3 針が必要です。25 ゲージは、この手法を用いて最小針サイズです。
組織の再生を刺激するために小さい皮の傷の能力は、12 microneedling13をふじょうフラクショナル レーザーなど臨床試験の手順の背後にある基本的な原則です。これらの治療法が光老化皮膚の外観を改善するために知られ、最近では、傷跡を改造を誘導し、機能を向上させるに、皮膚の整容傷跡14,15。これらの技術と豊富な臨床経験もさらに皮が特定の例外を除いて、ケースの大半でこれらの microinjuries 後の瘢痕を残さず治癒できる検証を提供します (フラクショナル レーザーふじょうは報道によると、3.8% 感染16、手続き後の肌のケアの重要性を強調した結果ほとんど常に、瘢痕の発生率)。また、ケロイドや肥厚性瘢痕の歴史を持つ人々 はこれらより小さい怪我しても瘢痕に敏感かもしれないしたがって、microinjuries の生産を含む治療を counterindicated 可能性があります。
長期的なドナー サイト合併症 (瘢痕、拘縮等) ことがあります私たちの以前の調査が直接治療効果、その他を引き起こすことがなく組織のかなりの量を収集する能力を高める皮の傷への配向柱状の適用に焦点を当てて他のアプリケーションの広い範囲のために有用であります。皮膚配向柱状文化拡大または解離と自己の皮膚細胞10の分散を伴うアプローチのティッシュ ソースとして役立つかもしれない。さらに、配向柱状ドナー サイト罹患率を最小限に抑えることの付加的な利点を提供し、付属器の構造との深い部分に存在する様々 な幹細胞/前駆細胞集団に関連する皮膚細胞の種類などを含む、(これは、出発原料として分割厚皮を利用する従来の方法では利用できません) 真皮11自家配向柱状も使えますex vivoアッセイで薬など様々 な刺激に対する組織の応答を研究するまたは従来とは異なり、化粧品携帯文化に基づく試金、各細胞と細胞外構造マイクロカラムは、それぞれ自然な構成の形式で保持されます。もっと一般に、アプローチを収穫マイクロカラム可能性があります小さなドナーの基本原理として (皮膚や他の器官) の組織工学・再生医療の各種に自家細胞・組織を提供することに広く適用できるも完全な傷のないヒーリングの傷は他の組織型に一般化する可能性があります。
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Disclosures
著者は、この記事でそこからライセンスを受けている、彼らの機関は、マサチューセッツ総合病院からのロイヤリティ収入で説明されている技術に関連する特許の共同発明者です。J. タムは Medline 工業、株式会社、この技術の商用ライセンスを保持しているのも調べます。
Acknowledgments
この作品は、陸軍、海軍、NIH、空軍、VA、保健賞号下の固い II 努力をサポートする部分で支えられましたW81XWH-13-2-0054。米陸軍医療研究集録活動、820 チャンドラー通り、フォート Detrick、MD 21702-5014 は表彰および管理取得オフィスです。意見、解釈、結論及び提言は、著者と国防総省によって必ずしも支持されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diamond wheel | Dremel | 545 | |
| Hypodermic needle (19G) | Fisher Scientific | 14-840-98 | Other needle sizes could be used, depending on experimental needs |
| Stone wheel | Dremel | 540 | |
| Syringe (20mL with luer lock) | Fisher Scientific | 22-124-967 | |
| Suction adapter | Tulip Medical | PA20BD | Optional, for high volume harvesting |
| Suction canister | Fisher Scientific | 19-898-212 | Optional, for high volume harvesting. Sterilize before use. |
| Suction tubing | Medline | DYND50216H | Optional, for high volume harvesting |
References
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