Analyse av kreft cellen invasjon og anti-metastatisk narkotikarelaterte Screening bruker Hydrogel mikro-kammer Array (HMCA)-baserte plater

Summary

En HMCA-basert bildebehandling plate er presentert for invasjonen analysen ytelse. Denne platen forenkler dannelsen av tredimensjonale (3D) svulst spheroids og måling av kreft cellen invasjonen i den ekstracellulære matrisen (EFM). Invasjonen analysen kvantifiseringen oppnås ved halvautomatisk analyse.

Abstract

Kreft metastasering er kjent at 90% av kreft dødelighet. Metastasering er en flertrinns prosess som starter med penetrasjon/invasjonen av svulst cellene i nærliggende vev. Dermed er invasjonen et viktig skritt i metastasering, gjør invasjonen prosess forskning og utvikling av anti-metastatisk narkotika, stor betydning. For å møte denne etterspørselen, det er behov for å utvikle 3D i vitro modeller som imiterer arkitektur solide svulster og deres microenvironment nærmest til i vivo tilstand på den ene siden, men samtidig være reproduserbare, robust og egnet for høy kapasitet og høy innhold målinger. Foreløpig mest invasjonen analyser lene på sofistikerte microfluidic teknologi som er tilstrekkelig for forskning, men ikke for høyt volum narkotikarelaterte screening. Andre analyser plate-baserte enheter med isolerte individuelle spheroids i hver brønn er materiale forbruker og har lav utvalgsstørrelsen per betingelse. Målet med gjeldende protokollen er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Vi utviklet en 3D-modell for invasjonen analysen basert på HMCA tenkelig plate til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk medisiner. Denne enheten kan mange uniform spheroids per brønn (høy utvalgsstørrelsen per betingelse) omgitt av ECM komponenter, mens kontinuerlig og samtidig observere og måle spheroids på ett element oppløsning for middels gjennomstrømming screening av anti-metastatisk narkotika. Denne plattformen er presentert her av produksjonen av HeLa og MCF7 spheroids for exemplifying enkelt celle og kollektive invasjonen. Vi sammenligne påvirkning av ECM komponent hyaluronic syre (HA) på invasiv kapasiteten av kollagen rundt HeLa spheroids. Til slutt, vi introdusere Fisetin (invasjonen hemmer) HeLa spheroids og nitrogenoksid (ingen) (invasjonen Aktivator) til MCF7 spheroids. Resultatene analyseres av Husets programvare som gjør halvautomatisk, enkel og rask analyse som gjør flere parameter eksamen.

Introduction

Døden skyldes hovedsakelig til formidling av metastatisk celler til fjerntliggende steder. Mange anstrengelser i kreftbehandling fokusere på målretting eller hindre dannelsen av metastatisk kolonier og progresjon av systemisk metastaser¹. Kreft celle migrasjon er et viktig skritt i svulst metastasering prosessen, dermed forskning kreft invasjonen cascade er svært viktig og en forutsetning for å finne anti-metastatisk therapeutics.

Bruk av dyr modeller som verktøy for å studere metastatisk sykdom har blitt funnet for å være svært dyrt og ikke alltid representative for svulst i mennesker. Videre er påvirke den ekstracellulære microenvironment topologi, mekanikk og komposisjon sterkt kreft cellen oppførsel². Siden i vivo modeller iboende mangel evnen å skille og kontrollere slike spesifikke parametere som bidrar til kreft invasjon og metastasering, er det behov for kontrollerbar biomimetic i vitro modeller.

For å kunne metastase å fjerne organer, må kreftceller utstilling vandrende og invasive fenotypiske trekk som kan målrettes for terapi. Men siden de fleste i vitro kreft modeller ikke etterligne faktiske funksjonene i solide svulster³, er det svært utfordrende å oppdage fysiologisk relevante fenotyper. I tillegg dikterer til fenotypiske heterogene som finnes i svulsten, behovet for å analysere svulst overføring på ett element oppløsning for å oppdage fenotypen rettet behandlinger, for eksempel ved å målrette metastasering-starte cellen befolkningen i heterogene svulster⁴.

Studiet av cellen motilitet og kollektiv migrasjon gjennomføres hovedsakelig monolayer kulturer av epitelceller på homogen Plane overflater. Disse konvensjonelle mobilnettet modeller for kreft celle migrasjon er basert på befolkningen analyse av enkeltceller invadere gjennom membraner og ECM komponenter⁵, men i slike systemer, iboende forskjellene mellom individuelle celler ikke studerte. Genererer 3D spheroids via stillaser eller stillaset uten mikro-strukturer er regnet som en overlegen betyr å studere svulst celle vekst og kreft invasjonen^6,7,8. Men mest 3D systemer er ikke egnet til høy gjennomstrømning formater, og mellom spheroid interaksjon vanligvis oppnås ikke siden isolerte individuelle spheroids genereres i hver mikro-og⁹. Studier med kreft overføringen er basert på microfluidic enheter^3,10,11,12, men disse sofistikerte microfluidic verktøy er vanskelig å produsere og ikke kan brukes for høy gjennomstrømning screening (HTS) av anti-invasiv narkotika.

To viktigste fenotyper, kollektive og individuelle celle migrasjon, som spiller en rolle i kreftceller overvinne ECM barrieren og invadere nærliggende vev, har blitt demonstrert^13,14, hver viser atskilte morfologiske egenskaper, biokjemiske, molekylære og genetiske mekanismer. I tillegg er to former for overføring kreftceller, fibroblast-like og amoeboid, observert i hver fenotypen. Siden både invasjonen fenotyper og migrasjon moduser, defineres hovedsakelig av morfologiske egenskaper, det er behov for mobilnettet modeller som aktiverer imaging-basert oppdagelsen og undersøkelse av alle former for svulst invasjon og migrere celler.

Det overordnede målet med det aktuelle metoden er å gi en enkel og reproduserbar biomimetic 3D i vitro cellen-basert system for analyse av invasjonen kapasitet i store populasjoner av svulst spheroids. Her introduserer vi HMCA-baserte 6-og bildebehandling platen til forskning av svulst invasjon og anti-metastatisk terapi. Teknologien gjør det mulig for dannelsen av et stort antall uniform 3D svulst spheroids (450 per brønn) i en hydrogel mikro-kammer (MC) struktur. Ulike ECM-komponenter er lagt til spheroid matrisen aktivere invasjonen av cellene i omgivelsene. Invasjonen er kontinuerlig overvåket av kort – og langsiktige observasjon av samme personlige spheroids/invadere celler og muliggjør morfologiske karakterisering, fluorescerende flekker og gjenfinning av bestemt spheroids når som helst. Siden mange spheroids deler plassen og medium, er kommunikasjon via løselige molekyler mellom individuelle spheroids og deres innvirkning på hverandre mulig. Halvautomatisk bildeanalyser utføres ved hjelp av interne MATLAB kode som gjør det raskere og mer effektiv samling av store mengder data. Plattformen forenkler nøyaktig, samtidig måling av mange spheroids/invadere celler på en tidkrevende måte, slik at medium gjennomstrømming screening av anti-invasjonen narkotika.

Protocol

1. HMCA Plate relieff Merk: Hele prosessen for design og fabrikasjon av polydimethylsiloxane (PDMS) stempel og HMCA tenkelig platen brukes i denne protokollen er beskrevet i detalj i våre tidligere artikler15,16. PDMS stempelet (negativ shape) brukes til å skrive HMCA (positiv figur) som består av ca 450 MCs per brønn (figur 1A). Som vist i figur 1B, hver av MCs har en form …

Representative Results

Den unike HMCA imaging platen brukes for invasjonen analysen av 3D svulst spheroids. Hele analysen, begynner med spheroid dannelse og slutter med invasjonen prosessen og flere manipulasjoner, utføres innen samme plate. For formet formasjon, HeLa celler er lastet inn i matrisen bassenget og bosette seg i hydrogel MCs av tyngdekraften. Hydrogel MCs, som har ikke-tilhenger/lav vedlegg egenskaper, lette celle-celle samspillet og dannelse av 3D svulst spheroids. Figur 2A<…

Discussion

Det er godt dokumentert at levende organismer, preget av komplekse 3D flercellet organisasjonen er ganske forskjellige fra de vanlige 2D monolayer kultivert cellene, understreker avgjørende måtte bruke mobilnettet modeller som bedre etterligner funksjonene og prosesser av den levende organismen for narkotika screening. Nylig har flercellet spheroids, organotypic kulturer, organoids og organer på-chip vært introdusert⁸ for bruk i standardiserte medisiner. Men truer 3D flercellet modellens stor …

Materials

6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics