Análise de invasão de células de câncer e usando a matriz de hidrogel Microcâmara (HMCA) de despistagem de drogas antimetastática-baseado placas

Summary

Uma placa de imagem baseada em HMCA é apresentada para o desempenho do ensaio de invasão. Este prato facilita a formação de esferoides tridimensional (3D) tumor e a medição da invasão de células de câncer na matriz extracelular (ECM). A quantificação de ensaio de invasão é conseguida análise semiautomático.

Abstract

Metástase do cancro é conhecido por causar a 90% de letalidade do câncer. Metástase é um processo de várias fases que se inicia com a penetração/invasão de células tumorais no tecido vizinho. Assim, a invasão é um passo crucial na metástase, tornando a invasão processo de pesquisa e desenvolvimento de drogas antimetastáticos, altamente significativo. Para atender a essa demanda, há uma necessidade de desenvolver modelos 3D em vitro que imitam a arquitetura de tumores sólidos e seu microambiente mais estreitamente para o vivo estado por um lado, mas ao mesmo tempo ser reprodutível, robusto e apropriado para alto rendimento e altas conteúdas medições. Atualmente, a maioria dos ensaios de invasão inclinar-se em tecnologias sofisticadas microfluidic adequados para pesquisa, mas não para triagem de drogas de alto volume. Outros ensaios usando dispositivos baseados em placa com esferoides individuais isolados em cada poço estão consumindo material e tem o tamanho de amostra baixa por condição. O objetivo do protocolo atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Desenvolvemos um modelo 3D para ensaio de invasão com base na placa da imagem latente de HMCA para a pesquisa de invasão do tumor e descoberta de drogas antimetastático. Este dispositivo permite a produção de numerosos esferoides uniformes por alvéolo (tamanho da amostra alta por condição) rodeado por componentes de ECM, enquanto continuamente e simultaneamente observar e medir os esferoides em resolução de elemento único para o meio seleção da produção de drogas antimetastáticas. Esta plataforma é aqui apresentada pela produção de esferoides HeLa e MCF7 para exemplificando unicelulares e invasão coletiva. Comparamos a influência do ácido hialurônico componente ECM (HA) sobre a capacidade invasiva de colágeno ao redor HeLa esferoides. Finalmente, não apresentamos Fisetin (inibidor de invasão) para HeLa esferoides e óxido nítrico () (ativador de invasão) para MCF7 esferoides. Os resultados são analisados pelo software interno que permite a análise semiautomático, simples e rápido, que facilita a análise multiparâmetro.

Introduction

Morte por cancro é atribuído principalmente à divulgação de células metastáticas para locais distantes. Muitos esforços no tratamento do câncer enfocam segmentação ou impedindo a formação de colônias metastáticas e progressão da doença metastática sistêmica¹. Migração de células de câncer é um passo crucial no processo de metástase de tumor, assim, a pesquisa de cascata de invasão de câncer é muito importante e um pré-requisito para encontrar terapêutica antimetastática.

O uso de modelos animais como ferramentas para estudar doença metastática foi encontrado para ser muito caro e não sempre representativa do tumor em seres humanos. Além disso, a topologia do microambiente extracelular, a mecânica e a composição afetam fortemente câncer célula comportamento². Desde que na vivo modelos inerentemente faltam de capacidade para separar e controlar tais parâmetros específicos que contribuem para a invasão do câncer e metástase, há uma necessidade de biomimetic controlável em vitro modelos.

Fim de metástase para órgãos distantes, as células cancerosas devem apresentar traços fenotípicos migratórios e invasivos que podem ser direcionados para a terapia. No entanto, desde que a maioria em vitro câncer de modelos não imitar as características reais de tumores sólidos³, é muito difícil de detectar fenótipos fisiologicamente relevantes. Além disso, a heterogeneidade fenotípica que existe dentro do tumor, dita a necessidade de analisar a migração do tumor em resolução de elemento único para descobrir terapias fenótipo-dirigido, por exemplo, pela segmentação da célula de metástase-iniciando população no tumores heterogêneos⁴.

O estudo da motilidade celular e migração coletiva é realizado principalmente em culturas de monocamadas de células epiteliais em superfícies planas homogêneas. Estes modelos de celulares convencionais para a migração de células de câncer são baseados sobre a análise da população de células individuais, invadindo através das membranas e ECM componentes⁵, mas em tais sistemas, as diferenças intrínsecas entre células individuais não podem ser estudou. Geração 3D esferoides através de andaimes ou em microestruturas de andaime-livre é considerado como um superior significa estudar o tumor de células crescimento e câncer invasão^6,7,8. No entanto, mais sistemas 3D não são adequados para formatos de alta produtividade e interação inter esferoide geralmente não pode ser alcançada desde esferoides individuais isolados são gerados em cada micropoço de⁹. Estudos recentes, envolvendo a migração de câncer são baseados em microfluidic dispositivos^3,10,11,12, no entanto, estas sofisticadas microfluidic ferramentas são difíceis de produzir e não pode ser usado para alto throughput screening (HTS) de drogas anti-invasivas.

Dois principais fenótipos, migração de células individuais e coletivas, que desempenham um papel nas células tumorais, superar a barreira de ECM e invadir tecidos vizinhos, tem sido demonstrada^13,14, cada exibindo distintas morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares e genéticos. Além disso, duas formas de migração células tumorais, como fibroblasto e ameboides, são observadas em cada fenótipo. Desde ambos, invasão fenótipos e modos de migração, principalmente são definidos pelas propriedades morfológicas, há uma necessidade para celular modelos essa detecção baseada em imagem de habilitar e exame de todas as formas de invasão do tumor e a migração de células.

O objectivo geral do método atual é fornecer um sistema simples e reprodutível biomimetic 3D em vitro baseados em células para a análise da capacidade de invasão em grandes populações de esferoides de tumor. Aqui, apresentamos a baseado no HMCA 6 imagem placa para a investigação de invasão do tumor e terapia antimetastática. A tecnologia permite a formação de um grande número de esferoides uniforme tumor 3D (450 por alvéolo) em uma estrutura de microcâmaras (MC) de hidrogel. Vários componentes de ECM são adicionados para a matriz de esferoide para permitir a invasão das células para o meio ambiente. Processo de invasão é continuamente monitorado pela observação de curto e longo prazo das células individuais de esferoides/invadir mesmo e facilita a caracterização morfológica, coloração fluorescente e recuperação de esferoides específicos em qualquer ponto. Desde numerosos esferoides compartilham o espaço e meio, interação através de moléculas solúveis esferoides individuais e seu impacto na outra é possível. Análise de imagem semiautomática é executada usando in-house código MATLAB que possibilita mais rápida e eficiente coleta de grande quantidade de dados. A plataforma facilita a medição exata, simultânea de numerosas células esferoides/invadindo de forma tempo-eficiente, permitindo o rastreio com throughput médio de drogas anti-invasão.

Protocol

1. HMCA placa de gravação Nota: O processo completo para a concepção e fabricação de polidimetilsiloxano (PDMS) carimbo e placa de imagem HMCA, utilizados neste protocolo é descrito em detalhes em nossos artigos anteriores de15,16. O carimbo PDMS (forma negativa) é usado para imprimir o HMCA (forma positiva), que consiste de cerca de 450 MCs por alvéolo (figura 1A). Conforme demonstrado na <strong c…

Representative Results

O único HMCA placa de imagem é usado para o ensaio de invasão de esferoides tumor 3D. O ensaio inteiro, começando com a formação de esferoide e terminando com o processo de invasão e manipulações adicionais, é realizado dentro do mesmo prato. Para a formação de esferoide, as células HeLa são carregadas para a bacia de matriz e ambientar o hidrogel MCs pela gravidade. O hidrogel de MCs, que têm características de fixação não-aderente/low, facilitar a interação célula-…

Discussion

Está bem documentado que os organismos vivos, caracterizados por sua complexa organização multicelular 3D são bastante distintos das células comumente usados monocamada 2D cultivada, enfatizando a necessidade crucial de usar modelos de celulares que melhor imitam as funções e triagem de processos do organismo vivo para drogas. Recentemente, multicelulares esferoides, culturas de organotypic, organoids e órgãos-em-um-microplaqueta foram introduzidos⁸ para o uso na descoberta de medicamento…

Materials

6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	P06-14-1.5-N	Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520100	A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C
Trypsin EDTA solution B	Biological Industries	03-052-1A	Warmed to 37°C before use
DMEM medium, high glucose	Biological Industries	01-055-1A	Warmed to 37°C before use
Special Newborn Calf Serum (NBCS)	Biological Industries	04-122-1A	Heat Inactivated
DPBS (10X), no calcium, no magnesium	Biological Industries	02-023-5A	Kept on ice before use
NaOH, anhydrous	Sigma-Aldrich	S5881-500G	Used for the preparation of 1M NaOH solution
Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml	Trevigen	3440-100-01	Kept on ice before use
Hyaluronic acid sodium salt	Sigma-Aldrich	H5542-10MG	Kept on ice before use
Fisetin	Sigma-Aldrich	F505-100MG	Added to the culture medium, invasion inhibitor
DETA/NO	Enzo Life Sciences	alx-430-014-m005	Added to the culture medium, nitric oxide donor
PI	Sigma-Aldrich	P4170	Used at very low concenrtation without the need for washing
Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply	Dymax Corporation	PN 39823	Used for HMCA plate sterilization by UV
Inverted IX81 microscope	Olympus		Used for automatic image acquisition
Incubator for microscope	Life Imaging Services		Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere
Sub-micron motorized stage type SCAN-IM	Marzhauser Wetzlar GmbH		Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition
14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera	Hamamatsu Photonics		Highly sensitive, used for imaging
Fluorescent filter cube for PI detection	Chroma Technology Corporation		Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm
The Olympus Cell^P operating software	Olympus		Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition
Matlab R2014B analysis software	Mathworks		Used to develop in house graphic user interface for image analysis
Excel software	Microsoft		Used for data management, calculation, plot creation and statistics