Analyse d’Invasion des cellules du Cancer et des médicaments anti-métastatique dépistage utilisant Hydrogel micro-chambre Array (HMCA)-plaques de base
Summary
Une plaque d’imagerie basée sur HMCA est présentée pour la performance de série invasion. Cette plaque facilite la formation des sphéroïdes en trois dimensions (3D) tumeur et la mesure de l’invasion des cellules du cancer dans la matrice extracellulaire (ECM). La quantification de dosage d’invasion est obtenue par analyse semi-automatique.
Abstract
Métastases du cancer est connu pour causer des 90 % de létalité du cancer. Métastase est un processus à plusieurs étapes qui initie avec la pénétration/invasion des cellules tumorales dans les tissus voisins. Ainsi, l’invasion est une étape cruciale à la métastase, rendant l’invasion processus recherche et le développement de médicaments anti-métastatiques, hautement significative. Pour répondre à cette demande, il est nécessaire de développer des modèles 3D dans vitro qui imitent l’architecture des tumeurs solides et leur microenvironnement plus étroitement à l’état in vivo d’une part, mais en même temps être reproductible, robuste et adapté aux haut rendement et hautes teneur Mensurations. Actuellement, la plupart analyses d’invasion se pencher sur technologies microfluidiques sophistiqués qui sont adéquates pour la recherche, mais pas pour le dépistage des drogues un volume élevé. Autres dosages utilisant des dispositifs à base de plaque avec des sphéroïdes individuels isolés dans chaque puits sont matériel consommant et ont la taille de l’échantillon faible par l’État. L’objectif du protocole actuel est de fournir un système de base de cellules 3D biomimétique simple et reproductible pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Nous avons développé un modèle 3D pour invasion analyse basée sur la plaque d’imagerie HMCA de recherche sur l’invasion tumorale et la découverte de médicaments anti-métastatique. Ce dispositif permet la production de nombreux sphéroïdes uniformes par puits (taille de l’échantillon élevé par État) entouré de composantes d’ECM, tout en permanence et simultanément observer et mesurer les sphéroïdes à élément simple résolution pour les moyennes criblage de médicaments anti-métastatiques. Cette plateforme est présentée ici par la production des sphéroïdes HeLa et MCF7 pour illustrant la cellule individuelle et collective invasion. Nous comparons l’influence de l’ECM composant l’acide hyaluronique (HA) sur les capacités invasives de collagène qui entourent les sphéroïdes HeLa. Enfin, nous ne présentons fisétine (inhibiteur de l’invasion) HeLa sphéroïdes et l’oxyde nitrique () (activateur d’invasion) à MCF7 sphéroïdes. Les résultats sont analysés par un logiciel interne qui permet l’analyse semi-automatique, simple et rapide qui facilite l’examen des paramètre multiples.
Introduction
Décès par cancer est attribuée principalement à la diffusion des cellules métastatiques à des endroits éloignés. Beaucoup d’efforts dans le traitement du cancer se consacrée sur le ciblage ou de prévenir la formation de colonies métastatiques et la progression de la maladie métastatique systémique1. Migration des cellules du cancer est une étape cruciale dans le processus de métastase tumorale, ainsi, la recherche de la cascade d’invasion du cancer est très important et une condition préalable à la recherche de thérapies anti-métastatique.
L’utilisation de modèles animaux comme outils pour l’étude de la maladie métastatique s’est avérée pour être très coûteux et pas toujours représentatifs de la tumeur chez les humains. En outre, la topologie du microenvironnement extracellulaire, la mécanique et la composition fortement affectent cancer cell comportement2. Car en vivo modèles intrinsèquement n’ont pas la capacité de séparer et de contrôler ces paramètres spécifiques qui contribuent à l’invasion du cancer et des métastases, on a besoin pour biomimétique contrôlables en vitro modèles.
Pour métastaser dans des organes éloignés, cellules cancéreuses doivent présenter des caractéristiques phénotypiques migrateurs et envahissantes qui peuvent être ciblés pour la thérapie. Toutefois, étant donné que la plupart des modèles in vitro du cancer ne pas imiter les caractéristiques réelles des tumeurs solides3, c’est très difficile de détecter des phénotypes physiologiquement pertinents. En outre, l’hétérogénéité phénotypique qui existe au sein de la tumeur, dicte la nécessité pour l’analyse des migrations de la tumeur à élément simple résolution afin de découvrir les thérapies axées sur le phénotype, par exemple, en ciblant les cellules déclenchant les métastases population au sein de tumeurs hétérogènes4.
L’étude de la motilité cellulaire et migration collective est menée principalement dans des cultures monocouches de cellules épithéliales sur des surfaces planes homogènes. Ces modèles cellulaires classiques pour la migration des cellules du cancer sont basées sur l’analyse de populations de cellules individuelles envahir à travers les membranes et les ECM composants5, mais dans ces systèmes, les différences intrinsèques entre les cellules individuelles ne peuvent pas être a étudié. Générer des sphéroïdes 3D par échafaudages ou en microstructures exempte d’échafaudage est considéré comme un supérieur moyen étudier la tumeur de cellules croissance et cancer invasion6,7,8. Cependant, la plupart des systèmes 3D ne sont pas adaptés aux formats à haut débit, et interaction entre sphéroïde habituellement ne peut être atteints depuis sphéroïdes individuels isolés sont générés à chaque micro puits9. Des études récentes portant sur la migration du cancer reposent sur des dispositifs microfluidiques3,10,11,12, cependant, ces complexes microfluidique outils sont difficiles à produire et ne peut pas servir à haut débit (HTS) de dépistage des drogues anti-invasives.
Deux principaux phénotypes, migration des cellules individuelles et collectives, qui jouent un rôle dans les cellules tumorales, surmonter l’obstacle de l’ECM et envahissent les tissus voisins, ont été démontrées13,14, chaque affichage distinct morphologiques caractéristiques, les mécanismes biochimiques, moléculaires et génétiques. En outre, les deux formes de migration des cellules tumorales, fibroblastes-like et amiboïdes, sont observées dans chaque phénotype. Depuis les deux phénotypes de l’invasion et les modes de migration, sont principalement définies par les propriétés morphologiques, il y a un besoin pour cellulaires modèles qu’activer la détection basée sur l’imagerie et l’examen de toutes les formes de l’invasion tumorale et la migration des cellules.
L’objectif global de la méthode actuelle doit fournir un système de biomimétique simple et reproductible 3D in vitro sur les cellules pour l’analyse de la capacité d’invasion dans les grandes populations des sphéroïdes de tumeur. Ici, nous introduisons la plaque d’imagerie basée sur HMCA 6 puits de recherche sur l’invasion tumorale et de la thérapie anti-métastatique. Cette technologie permet la formation d’un grand nombre des sphéroïdes de tumeur 3D uniforme (450 / puits) dans une structure de micro-chambres (MC) d’hydrogel. Divers composants de l’ECM sont ajoutés au tableau sphéroïde pour permettre l’invasion des cellules dans le milieu environnant. Processus d’invasion est surveillée de façon continue par l’observation des cellules individuelles sphéroïdes/envahir même court et long terme et facilite la caractérisation morphologique, coloration fluorescente et récupération des sphéroïdes spécifiques à tout moment. Puisque les sphéroïdes nombreux partagent l’espace et médium, interaction par l’intermédiaire de molécules solubles sphéroïdes individuels et leur impact sur l’autre est possible. Analyse d’images semi-automatique est effectué au moyen de code interne de MATLAB qui permet une collecte plus rapide et plus efficace de grandes quantités de données. La plateforme facilite la mesure précise et simultanée de nombreuses cellules sphéroïdes/envahir temps-efficacement, permettant le criblage de débit moyen des médicaments anti-invasion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est bien documenté que les organismes vivants, caractérisés par leur organisme multicellulaire 3D complexe sont tout à fait distinctes des cellules utilisées monocouche 2D cultivée, en insistant sur la nécessité cruciale d’utiliser des modèles cellulaires qui mieux imitent les fonctions et les processus de l’organisme vivant pour médicament dépistage. Récemment, les sphéroïdes multicellulaires, culture organotypique, organoïdes et organes-on-a-chip ont été introduites8 pour…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par le legs de Moshe Shimon et Judith Weisbrodt.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
References
- Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
- Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
- Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
- Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33 (2016).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
- Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
- Lee, E., Song, H. -. H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
- Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293 (2017).
- Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811 (2013).
- Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784 (2017).
- Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544 (2016).
- Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -. R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
- Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
- Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005 (2017).
- Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
- Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
- Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063 (2016).
- Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114 (2012).
- Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007 (2012).
- Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
- Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001 (2017).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686 (2015).
- Toh, Y. -. C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. 생체공학. 5 (2), 29 (2018).
- Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
- Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502 (2014).
- Lee, S. -. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
- Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
- Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
- Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
- Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
- Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
- Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
- Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
- Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
- Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).
