Analyse der Krebs Zellinvasion und anti-metastatischen Drogen-Screening mit Hydrogel Micro-Kammer Array (HMCA)-basierte Platten
Summary
Eine HMCA-basierte Speicherfolie wird für Invasion Testleistung vorgestellt. Diese Platte erleichtert die Bildung von dreidimensionalen (3D) Tumor Sphäroide und die Messung der Krebs Zelle eindringen in die extrazelluläre Matrix (ECM). Die Invasion-Assay-Quantifizierung wird durch halbautomatische Analyse erreicht.
Abstract
Krebsmetastasen ist bekannt, 90 % der Letalität Krebs verursachen. Metastasierung ist ein mehrstufiger Prozess, der mit der Durchdringung/Invasion von Tumorzellen in benachbarte Gewebe initiiert. Somit ist Invasion ein entscheidender Schritt in Metastasen, machen die Invasion Prozessforschung und Entwicklung von Anti-metastatischen Drogen hochsignifikant. Um diese Nachfrage zu begegnen, besteht die Notwendigkeit, 3D in-vitro- Modelle zu entwickeln, die die Architektur von soliden Tumoren zu imitieren und ihrer Mikroumgebung am ehesten zu in Vivo Staat auf der einen Seite, aber zur gleichen Zeit werden reproduzierbar, robust und geeignet für hohe Ergiebigkeit und hohe Content Messungen. Derzeit, lehnen die meisten Invasion Assays auf anspruchsvolle mikrofluidischen Technologien, die ausreichend sind für die Forschung aber nicht für hochvolumige Drogen-Screening. Andere Tests mit Platte-basierten Geräten mit isolierten einzelnen Sphäroide in jede Vertiefung sind Material verbrauchen und geringen Stichprobengröße pro Zustand haben. Das aktuelle Protokoll soll eine einfache und reproduzierbare biomimetische zellbasierte 3D-System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide schaffen. Wir entwickelten ein 3D-Modell für Invasion Assay anhand HMCA Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Wirkstoffforschung. Dieses Gerät ermöglicht die Produktion von zahlreichen einheitliche Sphäroide pro Bohrloch (hohe Stichprobengröße pro Zustand) umgeben von ECM-Komponenten, während gleichzeitig und kontinuierlich beobachten und messen die Sphäroide bei einem Element Auflösung für mittlere Durchsatz-Screening von Anti-metastatischen Drogen. Diese Plattform wird hier durch die Produktion von HeLa und MCF7 Sphäroide zur Veranschaulichung einzelne Zelle und kollektive Invasion vorgestellt. Wir vergleichen den Einfluss der ECM-Komponente-Hyaluronsäure (HA) auf die invasive Kapazität von Kollagen um HeLa Sphäroide. Schließlich stellen wir Fisetin (Invasion Hemmer) HeLa Sphäroide und Stickstoffmonoxid (NO) (Invasion Aktivator), MCF7 Sphäroide. Die Ergebnisse werden von Inhouse-Software analysiert die halbautomatische, einfache und schnelle Analyse ermöglicht die Multi-Parameter-Prüfung erleichtert.
Introduction
Krebstod ist vor allem auf die Verbreitung von metastasierenden Zellen an weit entfernten Orten zurückzuführen. Viele Bemühungen in der Krebsbehandlung auf targeting oder verhindern die Bildung von Metastasen Kolonien und das Fortschreiten der systemische Metastasen1konzentrieren. Krebs Zelle Migration ist ein entscheidender Schritt in der Tumor-Metastasen-Prozess, also die Erforschung von Krebs Invasion Kaskade ist sehr wichtig und eine Voraussetzung zur Suche nach Anti-metastatischen Therapeutika.
Die Verwendung von Tiermodellen als Hilfsmittel für das Studium metastasierten Erkrankung wurde sehr teuer und nicht immer repräsentativ für den Tumor beim Menschen festgestellt. Darüber hinaus beeinflussen die extrazelluläre Mikroumgebung Topologie, die Mechanik und die Zusammensetzung stark Krebs Zelle Verhalten2. Da in Vivo Modellen von Natur aus nicht in der Lage zu trennen und so spezifische Parameter, die zu Krebs Invasion und Metastasierung beitragen zu kontrollieren, gibt es eine Notwendigkeit für steuerbare biomimetische in-vitro- Modelle.
Um auf entfernte Organe metastasieren, müssen Krebszellen wandernden und invasive phänotypische Merkmale aufweisen, die für die Therapie ausgerichtet werden können. Da die meisten in-vitro- Krebs Modelle nicht die tatsächlichen Eigenschaften von soliden Tumoren3imitieren, ist es jedoch sehr schwierig, physiologisch relevante Phänotypen erkennen. Darüber hinaus bestimmt die phänotypische Heterogenität, die in den Tumor, besteht die Notwendigkeit für die Analyse von Tumor-Migration bei einem Element Auflösung um Phänotyp gerichtete Therapien, zum Beispiel zu entdecken, indem Sie auf die Metastasen initiieren Zelle Bevölkerung in heterogenen Tumoren4.
Die Studie der Zelle Motilität und kollektiven Migration ist in erster Linie in Monolayer-Kulturen der Epithelzellen auf homogene planaren Flächen. Diese konventionellen Zellmodellen für Krebs Zellwanderung basieren auf die Bevölkerung Analyse einzelner Zellen eindringen durch die Membranen und ECM Komponenten5, aber in einem solchen System können nicht die Unterschiede zwischen den einzelnen Zellen werden studierte. Erzeugung von 3D Sphäroide oder über Gerüste Gerüst-freie Mikrostrukturen gilt als eine überlegene bedeutet, den Tumor zu studieren Zelle Wachstum und Krebs Invasion6,7,8. Jedoch die meisten 3D-Systeme eignen sich nicht zur Hochdurchsatz-Formate und Inter Sphäroid Interaktion kann nicht in der Regel erreicht werden, da in jedes Mikro-gut9isoliert einzelne Sphäroide erzeugt werden. Jüngste Studien mit der Krebs-Migration basieren auf mikrofluidischen Geräten3,10,11,12, jedoch diese anspruchsvolle mikrofluidischen Werkzeuge sind schwer zu produzieren und kann nicht Hochdurchsatz-screening (HTS) von Anti-invasive Drogen verwendet werden.
Zwei wichtigsten Phänotypen, kollektive und individuelle Zellwanderung, die eine Rolle in Tumorzellen die ECM-Barriere zu überwinden und benachbarte Gewebe eindringen wurden nachgewiesene13,14, jede Anzeige unterschiedliche morphologische Eigenschaften, biochemischen, molekularen und genetischen Mechanismen. Darüber hinaus werden zwei Formen der Migration von Tumorzellen, Fibroblasten-Like und amöboiden, in jeder Phänotyp beobachtet. Da beide Invasion Phänotypen und Migration-Modi, zeichnen sich vor allem durch morphologische Eigenschaften, gibt es eine Notwendigkeit für zelluläre Modelle dieser aktivieren Imaging-basierte Erkennung und Untersuchung aller Formen von Tumorinvasion und Migration-Zellen.
Das übergeordnete Ziel der aktuellen Methode ist eine einfache und reproduzierbare biomimetische 3D in-vitro- Zelle-basiertes System für die Analyse der Invasion Kapazität in großen Populationen von Tumor Sphäroide zur Verfügung zu stellen. Hier stellen wir die HMCA-basierte 6-Well Bildplatte für die Erforschung der Tumorinvasion und anti-metastatischen Therapie. Die Technologie ermöglicht die Bildung einer großen Zahl von einheitlichen 3D Tumor Sphäroide (450 pro Well) in einem Hydrogel Mikro-Kammern (MC) Struktur. Die Sphäroid Array ermöglichen das Eindringen der Zellen in der Umgebung sind verschiedene ECM-Komponenten hinzugefügt. Invasion-Prozess wird kontinuierlich überwacht, durch kurz- und langfristige Beobachtung der gleichen Sphäroide/Invasion der einzelnen Zellen und erleichtert Morphologische Charakterisierung, fluoreszierende Färbung und Abruf von spezifischen Sphäroide an jedem beliebigen Punkt. Da zahlreiche Sphäroide Raum und Medium teilen, ist die Interaktion über lösliche Moleküle zwischen einzelnen Sphäroide und deren Auswirkungen auf den anderen möglich. Semi-automatische Bildanalyse erfolgt über hauseigene MATLAB-Code schneller und effizienter Sammlung von großen Datenmengen ermöglicht. Die Plattform ermöglicht präzise, gleichzeitige Messung von zahlreichen Sphäroide/eindringenden Zellen Zeit effizient zu nutzen, so dass mittleren Durchsatz Screening von Anti-Invasion Drogen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist gut dokumentiert, dass lebende Organismen, zeichnet sich durch ihre komplexe 3D mehrzelligen Organisation ziemlich eindeutig aus den gängigen 2D Monolage kultivierten Zellen sind, entscheidende betonend, zelluläre Modelle verwenden die Funktionen besser imitieren und Prozesse des lebenden Organismus für Drug screening. Vor kurzem wurden mehrzelligen Sphäroide, organotypischen Kulturen, Organellen und Organe-on-a-Chip eingeführt8 für den Einsatz in standardisierten Wirkstoffforschung. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird durch das Vermächtnis von Moshe Shimon und Judith Weisbrodt unterstützt.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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