Analisi di invasione della cellula tumorale e anti-metastatica utilizzando Hydrogel Micro-camera matrice (HMCA) di Screening di stupefacenti-piastre di base
Summary
Un piatto di imaging basata su HMCA è presentato per prestazioni di test di invasione. Questa piastra facilita la formazione di sferoidi tridimensionali (3D) del tumore e la misurazione dell’invasione della cellula tumorale nella matrice extracellulare (ECM). La quantificazione di dosaggio di invasione avviene mediante analisi semi-automatica.
Abstract
Metastasi del cancro è conosciuta per causare il 90% della mortalità del cancro. La metastasi è un processo a più stadi che inizia con la penetrazione/invasione delle cellule del tumore nei tessuti vicini. Così, l’invasione è un passo cruciale nella metastasi, rendendo l’invasione processo ricerca e sviluppo di farmaci anti-metastatici, altamente significativo. Per rispondere a questa domanda, c’è una necessità di sviluppare modelli 3D in vitro che imitano l’architettura dei tumori solidi e loro microambiente maggiormente allo stato di in vivo su una mano, ma allo stesso tempo essere riproducibile, robusto e adatto per ad alto rendimento e alta misura del contenuto. Attualmente, la maggior parte delle analisi di invasione appoggiano microfluidici sofisticate tecnologie che sono sufficienti per la ricerca, ma non per lo screening di stupefacenti ad alto volume. Altre analisi utilizzando dispositivi basati su piastra con sferoidi isolati individuali in ciascun pozzetto sono materiale che consumano e hanno le dimensioni campione basso condizione. L’obiettivo del protocollo attuale è quello di fornire un sistema semplice e riproducibile biomimetici 3D basati su cellule per l’analisi della capacità di invasione in grandi popolazioni di sferoidi del tumore. Abbiamo sviluppato un modello 3D per analisi di invasione basato sul HMCA piatto imaging per la ricerca di invasione del tumore e di scoperta della droga anti-metastatica. Questo dispositivo consente la produzione di numerose sferoidi uniforme per pozzetto (dimensione del campione di alta condizione) circondato da componenti della MEC, mentre continuamente e contemporaneamente osservare e misurare le sferoidi a elemento singolo risoluzione per mezzo screening di resa di farmaci anti-metastatiche. Questa piattaforma è presentata qui dalla produzione di sferoidi HeLa e MCF7 per esemplificando la cella singola e collettiva invasione. Mettiamo a confronto l’influenza dell’ECM componente acido ialuronico (HA) sulla capacità invasiva del collagene circostante HeLa sferoidi. Infine, vi non presentiamo Fisetin (inibitore di invasione) a HeLa sferoidi e ossido nitrico () (attivatore di invasione) di MCF7 sferoidi. I risultati sono analizzati dal software interno che consente l’analisi semi-automatica, semplice e veloce che facilita l’esame multi-parametro.
Introduction
Morte per cancro è attribuita principalmente alla diffusione delle cellule metastatiche in luoghi distanti. Molti sforzi nel trattamento del cancro concentrano sul targeting o prevenire la formazione di colonie metastatiche e la progressione della malattia metastatica sistemica1. Migrazione delle cellule di cancro è un passo cruciale nel processo di metastasi del tumore, così, la ricerca della cascata di invasione del tumore è molto importante e un prerequisito per trovare terapie anti-metastatica.
L’uso di modelli animali come strumenti per lo studio della malattia metastatica è stato trovato per essere molto costoso e non sempre rappresentativo del tumore in esseri umani. Inoltre, la topologia del microambiente extracellulare, la meccanica e la composizione possono influenzare fortemente cancro cella comportamento2. Dato che in vivo modelli intrinsecamente mancano la capacità di separare e controllare tali parametri specifici che contribuiscono alla invasione tumorale e metastasi, c’è un’esigenza biomimetici controllabile in vitro modelli.
Per riprodurrsi per metastasi agli organi distanti, le cellule tumorali devono esibire tratti fenotipici migratori e invasivi che possono essere mirati per la terapia. Tuttavia, poiché la maggior parte dei modelli in vitro del cancro non imitare le effettive caratteristiche di tumori solidi3, è molto difficile da rilevare fenotipi fisiologicamente rilevanti. Inoltre, l’eterogeneità fenotipica che esiste all’interno del tumore, impone la necessità per l’analisi di migrazione di tumore a elemento singolo risoluzione al fine di scoprire terapie fenotipo-diretto, per esempio, prendendo di mira la cella d’inizio metastasi popolazione all’interno di tumori eterogenei4.
Lo studio della motilità cellulare e migrazione collettiva avviene principalmente in colture monostrato di cellule epiteliali su superfici piane omogenee. Questi modelli di cellulari convenzionali per migrazione delle cellule di cancro sono basati sull’analisi della popolazione delle singole cellule che invadono attraverso le membrane ed ECM componenti5, ma in tali sistemi, le differenze intrinseche tra le singole celle non possono essere ha studiato. Sferoidi 3D generazione tramite impalcature o in micro-strutture senza impalcatura è considerato come superior significa studiare il tumore delle cellule di cancro e crescita invasione6,7,8. Tuttavia, più sistemi 3D non sono adatti ad elevato throughput formati e interazione inter-sferoide solitamente non può essere realizzato poiché isolati sferoidi individuali vengono generati in ogni micro-pozzo9. Gli studi recenti che coinvolgono la migrazione di cancro si basano su microfluidic dispositivi3,10,11,12, tuttavia, questi sofisticati microfluidici strumenti sono difficili da produrre e non può essere utilizzato per high throughput screening (HTS) di farmaci anti-dilaganti.
Due fenotipi principali, migrazione cellulare collettiva e individuale, che svolgono un ruolo in cellule del tumore, superando la barriera di ECM e invadendo il tessuto vicino, sono stati dimostrati13,14, ogni visualizzazione distinte morfologica caratteristiche, meccanismi biochimici, molecolari e genetici. Inoltre, due forme di migrazione delle cellule del tumore, fibroblasto-come e ameboidi, sono osservate in ogni fenotipo. Dato che entrambi, fenotipi di invasione e le modalità di migrazione, principalmente sono definiti da proprietà morfologiche, c’è una necessità per cellulari modelli che attiva la rilevazione basata su formazione immagine e l’esame di tutte le forme di invasione del tumore e la migrazione di cellule.
L’obiettivo generale del metodo corrente è quello di fornire un sistema semplice e riproducibile biomimetici 3D in vitro basati su cellule per l’analisi della capacità di invasione in grandi popolazioni di sferoidi del tumore. Qui, presentiamo la piastra di imaging 6 pozzetti HMCA-based per la ricerca di invasione del tumore e la terapia anti-metastatica. La tecnologia consente la formazione di un gran numero di sferoidi tumore 3D uniforme (450 per pozzetto) in una struttura di micro-chambers (MC) di idrogel. Vari componenti della ECM vengono aggiunti alla matrice sferoide per abilitare l’invasione delle cellule nell’ambiente circostante. Processo di invasione è costantemente monitorato tramite l’osservazione a breve e a lungo termine delle stesse cellule individuali degli sferoidi che invade e facilita la caratterizzazione morfologica, colorazione fluorescente e il recupero di specifici sferoidi in qualsiasi punto. Poiché numerose sferoidi condividono spazi e medio, è possibile interagire tramite molecole solubili tra sferoidi individuali e il loro impatto su un altro. Analisi semi-automatica dell’immagine viene eseguita utilizzando il codice MATLAB in-House che consente la raccolta più veloce ed efficiente di grandi quantità di dati. La piattaforma facilita la misurazione accurata, simultanea di numerose cellule di sferoidi/invadendo in maniera efficiente, consentendo di screening su vasta scala medio di farmaci anti-invasione.
Protocol
Representative Results
Discussion
È ben documentato che gli organismi viventi, caratterizzati dalla loro organizzazione pluricellulare 3D complessi sono abbastanza distinti dalle cellule comunemente usato monostrato 2D coltivata, sottolineando la necessità cruciale di utilizzare modelli cellulari che meglio imitano le funzioni e processi dell’organismo vivente per droga di screening. Recentemente, sferoidi multicellulari, colture organotipiche, organoids e organi-on-a-chip sono stati introdotti8 per l’uso nella scoperta della dr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è supportato dal lascito di Moshe Shimon e Judith Weisbrodt.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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