Análisis de invasión de células de cáncer y uso de hidrogel Micro-cámara matriz (HMCA) de detección de drogas anti-metastásico-basado en placas
Summary
Una placa de imagen basado en el HMCA se presenta para el funcionamiento de ensayo de invasión. Esta placa facilita la formación de esferoides tumorales (3D) tridimensional y la medición de la invasión de células de cáncer en la matriz extracelular (ECM). La cuantificación del ensayo de invasión se logra por análisis semiautomático.
Abstract
Metástasis del cáncer se sabe que causan el 90% de mortalidad de cáncer. La metástasis es un proceso gradual que inicia con la penetración/invasión de células tumorales en el tejido vecino. Así, la invasión es un paso crucial en metástasis, haciendo la investigación del proceso de invasión y desarrollo de fármacos anti-metastásicos, altamente significativo. Para hacer frente a esta demanda, es necesario desarrollar modelos 3D en vitro que imitan la arquitectura de tumores sólidos y su microambiente más cerca a estado en vivo en una mano, pero al mismo tiempo ser reproducibles, robusta y conveniente para alto rendimiento y alto contenidas mediciones. Actualmente, la mayoría ensayos de invasión apoyan en tecnologías de microfluidos sofisticados que son adecuadas para la investigación pero no para la detección de drogas de alto volumen. Otros ensayos utilizando dispositivos basados en placa con esferoides individuales aisladas en cada pozo son material consumo y tamaño de la muestra baja por condición. El objetivo del protocolo actual es proporcionar un sistema de celulares 3D de biomiméticos simples y reproducibles para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Se desarrolló un modelo 3D para análisis de invasión basado en la placa de proyección de imagen de HMCA para la investigación de invasión del tumor y descubrimiento de fármacos anti-metastásico. Este dispositivo permite la producción de numerosos esferoides uniforme por pocillo (tamaño de la muestra alta por condición) rodeada por los componentes del ECM, mientras continuamente y al mismo tiempo observando y midiendo los esferoides en el solo elemento de resolución por medio proyección de producción de drogas anti-metastásicas. Esta plataforma se presenta aquí por la producción de HeLa y MCF7 esferoides para ejemplificar unicelular y la invasión colectiva. Comparar la influencia de la ECM componente el ácido hialurónico (HA) en la capacidad invasiva de colágeno que rodean esferoides de HeLa. Por último, no presentamos Fisetin (inhibidor de la invasión) HeLa esferoides y óxido nítrico () (activador de invasión) a MCF7 esferoides. Los resultados son analizados por el software interno que permite el análisis semi-automático, simple y rápido que facilita el examen de múltiples parámetro.
Introduction
Muerte por cáncer se atribuye principalmente a la difusión de las células metastásicas a lugares distantes. Muchos esfuerzos en el tratamiento del cáncer se centran en objetivos o impedir la formación de colonias metastásicas y progresión de la enfermedad metastásica sistémica1. Migración de la célula de cáncer es un paso crucial en el proceso de metástasis de tumor, por lo tanto, la investigación de la cascada de invasión del cáncer es muy importante y un requisito previo a la búsqueda de terapias anti-metastásico.
El uso de modelos animales como herramientas para el estudio de enfermedad metastásica se ha encontrado para ser muy costoso y no siempre representativa del tumor en los seres humanos. Por otra parte, la topología de microambiente extracelular, mecánica y composición afectan fuertemente cáncer célula comportamiento2. En vivo modelos intrínsecamente carecen de la habilidad de separar y controlar estos parámetros específicos que contribuyen a la invasión del cáncer y la metástasis, es necesario para biomiméticos controlable en vitro modelos.
Para metastatizar a órganos distantes, las células cancerosas deben exhibir rasgos fenotípicos invasivos y migratorios que pueden ser destinados a la terapia. Sin embargo, puesto que la mayoría en vitro modelos de cáncer no imitar las reales características de tumores sólidos3, es muy difícil detectar fenotipos fisiológicamente relevantes. Además, la heterogeneidad fenotípica que existe dentro del tumor, dicta la necesidad de analizar la migración del tumor en el solo elemento de resolución para descubrir terapias dirigidas por fenotipo, por ejemplo, apuntando a la celda de inicio de la metástasis población dentro de los tumores heterogéneos4.
El estudio de la motilidad celular y la migración colectiva se lleva a cabo principalmente en cultivos monocapa de células epiteliales en las superficies planas homogéneas. Estos modelos celulares convencionales de migración de la célula de cáncer se basan en el análisis de la población de células invasoras a través de las membranas y componentes de ECM5, pero en estos sistemas, las diferencias intrínsecas entre las células individuales no pueden ser estudió. Generación 3D esferoides mediante andamios o en micro-estructuras de andamio-libre se considera como un superior significa estudiar el tumor de la célula crecimiento y cáncer invasión6,7,8. Sin embargo, la mayoría de los sistemas 3D no son adecuados a los formatos de alto rendimiento y esferoide entre interacción generalmente no puede lograrse desde esferoides individuales aisladas se generan en cada micro pozo9. Estudios recientes que involucran la migración del cáncer se basan en dispositivos microfluídicos3,10,11,12, sin embargo, estos sofisticación microfluídicos herramientas son difíciles de producir y no puede ser utilizado para alto rendimiento (HTS) de detección de drogas anti-invasivas.
Dos fenotipos principales, migración de la célula individual y colectiva, que juegan un papel en las células del tumor superando la barrera de ECM e invadiendo tejidos vecinos, han demostrado13,14, cada uno mostrando distintos morfológica características, mecanismos bioquímicos, moleculares y genéticos. Además, dos formas de migración de las células de tumor, fibroblasto-como y ameboides, se observan en cada fenotipo. Desde ambos, fenotipos de invasión y modos de la migración, principalmente se definen por las características morfológicas, hay una necesidad para celulares modelos que permiten basado en proyección de imagen de detección y examen de todas las formas de invasión tumoral y la migración de las células.
El objetivo general del método actual es proporcionar un simple y reproducible biomiméticos 3D en vitro sistema basadas en células para el análisis de la capacidad de invasión en grandes poblaciones de esferoides tumorales. Aquí, presentamos la base de HMCA 6 imagen placa de pozos para la investigación de invasión del tumor y terapia anti-metastásica. La tecnología permite la formación de un gran número de esferoides tumorales 3D uniforme (450 por pozo) en una estructura de micro-cámaras (MC) de hidrogel. Varios componentes de la ECM se añaden a la matriz de esferoide para permitir la invasión de las células en el entorno. Proceso de invasión es continuamente supervisado por observación de corto y largo plazo de las mismas células esferoides individuales/invadiendo y facilita la caracterización morfológica, tinción fluorescente y recuperación de esferoides específicos en cualquier momento. Puesto que numerosos esferoides comparten espacio y medio, interacción a través de moléculas solubles entre esferoides individuales y su impacto el uno del otro es posible. Análisis de semi-automática de la imagen se realizan utilizando interno código MATLAB que permite la más rápida y eficaz recopilación de gran cantidad de datos. La plataforma facilita la medición precisa y simultánea de numerosas células esferoides/invadiendo de manera eficiente, permitiendo la proyección del rendimiento medio de los medicamentos de lucha contra la invasión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Está bien documentado que los organismos vivos, caracterizados por su compleja organización multicelular 3D son muy distintos de las células de la monocapa 2D utilizados cultivada, haciendo hincapié en la crucial necesidad de utilizar modelos celulares que mejor imitan las funciones y procesos de un organismo vivo para drogas. Recientemente, esferoides multicelulares, culturas organotypic, organoides y órganos-en-un-chip han sido introducidas8 para el uso en el descubrimiento de fármacos est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el legado de Moshe Shimon y Judith Weisbrodt.
Materials
| 6 Micro-well Glass Bottom Plates with 14 mm micro-well #1.5 cover glass | Cellvis | P06-14-1.5-N | Commercial glass bottom plates which are used for HMCA embossing |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520100 | A solution of 6% agarose is warmed up to 80°C before use, a solution of 1% agarose is warmed to 37°C |
| Trypsin EDTA solution B | Biological Industries | 03-052-1A | Warmed to 37°C before use |
| DMEM medium, high glucose | Biological Industries | 01-055-1A | Warmed to 37°C before use |
| Special Newborn Calf Serum (NBCS) | Biological Industries | 04-122-1A | Heat Inactivated |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Biological Industries | 02-023-5A | Kept on ice before use |
| NaOH, anhydrous | Sigma-Aldrich | S5881-500G | Used for the preparation of 1M NaOH solution |
| Cultrex Type I collagen from rat tail, 5mg/ml | Trevigen | 3440-100-01 | Kept on ice before use |
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H5542-10MG | Kept on ice before use |
| Fisetin | Sigma-Aldrich | F505-100MG | Added to the culture medium, invasion inhibitor |
| DETA/NO | Enzo Life Sciences | alx-430-014-m005 | Added to the culture medium, nitric oxide donor |
| PI | Sigma-Aldrich | P4170 | Used at very low concenrtation without the need for washing |
| Dymax 5000-EC UV flood lamp complete system with light shield & Dymax 400 Watt EC power supply | Dymax Corporation | PN 39823 | Used for HMCA plate sterilization by UV |
| Inverted IX81 microscope | Olympus | Used for automatic image acquisition | |
| Incubator for microscope | Life Imaging Services | Essential for time lapse experiments with image acquisition, pre adjusted to 37°C, 5% CO2 and keeping a humidified atmosphere | |
| Sub-micron motorized stage type SCAN-IM | Marzhauser Wetzlar GmbH | Used to predetermine image acquisition areas, for automatic image acquisition | |
| 14-bit, ORCA II C4742-98 cooled camera | Hamamatsu Photonics | Highly sensitive, used for imaging | |
| Fluorescent filter cube for PI detection | Chroma Technology Corporation | Filter cube specifications: excitation filter 530-550 nm, dichroic mirror 565 nm long pass and emission filter 600-660 nm | |
| The Olympus Cell^P operating software | Olympus | Software used to control microscope, motorized stage, camera and image acquisition | |
| Matlab R2014B analysis software | Mathworks | Used to develop in house graphic user interface for image analysis | |
| Excel software | Microsoft | Used for data management, calculation, plot creation and statistics |
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