Summary

Un modello di Mouse Hyperandrogenic per studiare la sindrome dell'ovaio policistico

Published: October 02, 2018
doi:

Summary

Descriviamo lo sviluppo di un modello murino di PCOS-come magro con pellet di diidrotestosterone per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Abstract

Iperandrogenismo svolge un ruolo critico nella funzione riproduttiva e metabolica nelle femmine ed è il segno distintivo della sindrome dell’ovaio policistico. Lo sviluppo di un modello di topo PCOS-come magro che imita le donne con PCOS è clinicamente significativo. In questo protocollo, descriviamo un tale modello. Con l’inserimento di una lunghezza di 4 mm di pellet di polvere DHT (diidrotestosterone) cristallo (lunghezza totale di pellet è di 8 mm), e sostituirlo ogni mese, siamo in grado di produrre un modello del mouse di PCOS-come con piega di 2 livelli DHT siero superiore rispetto ai topi non impiantati con DHT (no-DHT). Abbiamo osservato la disfunzione metabolica e riproduttiva senza modificare il peso corporeo e la composizione corporea. Mentre che esibiscono un alto grado di sterilità, un piccolo sottoinsieme di questi topi femminili PCOS-come può rimanere incinto e la loro prole pubertà ritardata e testosterone aumentato di adulti. Questo modello di mouse magra PCOS-come è uno strumento utile per studiare la fisiopatologia della PCOS e la discendenza da queste dighe di PCOS-come.

Introduction

Iperandrogenismo è il segno distintivo della sindrome dell’ovaio policistico (PCOS) secondo criteri NIH e dell’eccesso dell’androgeno e della società PCOS (AE-PCOS). Le donne con PCOS hanno difficoltà a rimanere incinta e hanno un aumentato rischio di complicazioni di gravidanza1. Anche se sono incinta, loro prole femminile hanno un2,di esiti negativi per la salute3. Modelli animali sono stati sviluppati utilizzando varie strategie4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e che esibiscono molte caratteristiche di PCOS (anovulazione, e o alterata tolleranza al glucosio e insulina) con aumento del peso corporeo e l’obesità associata con ingrossamento degli adipociti dimensioni e il peso maggiore del adipocyte. Esistono due strategie principali per produrre modelli animali che vengono utilizzati per studiare la PCOS. Uno è il trattamento con alti livelli di androgeni direttamente (androgeni esogeni iniezione/inserimento) o indirettamente (ad esempio bloccando la conversione di androgeni in estrogeni con inibitore dell’aromatasi) dopo nascita13. Un altro è di hyperexposure fetale di androgeni durante gestazione14,15 per studiare la prole. Ad esempio, prole femminile da scimmia rhesus16,17, pecore18e roditori esposti a maschi livelli di androgeni durante il periodo intrauterino sviluppare tratti di PCOS-come più tardi nella vita. Questi modelli significativamente migliorato la nostra comprensione degli effetti androgeni e programmazione fetale e uterini effetti ambientali. Tuttavia, questi modelli hanno i loro limiti: 1) gli animali sviluppano obesità e pertanto risulta difficile separare gli effetti di iperandrogenismo da obesità indotta riproduttivo e disfunzione metabolica; 2) prima della gravidanza, le donne con PCOS presentano già alti livelli di androgeni, così gli ovociti sono stati esposti agli androgeni in eccesso prima della fecondazione; 3) le dosi farmacologiche di testosterone (T) o diidrotestosterone (DHT) utilizzato dopo la nascita o durante la gestazione potrebbero non riflettere l’ambiente dell’androgeno di PCOS. Livelli di testosterone e DHT sono stati misurati nel fluido follicolare ovarico e/o del siero, e testosterone ed i livelli di DHT sono 1.5 a 3,9 volte superiore nelle donne con PCOS5,19,20,21 ,22,23 rispetto alle donne inalterate. Abbiamo creato un topo adulto modello23,24,25 che si sviluppa la disfunzione metabolica e riproduttiva entro due settimane dall’inizio dell’esposizione cronica di DHT dall’inserimento di una pallina con lunghezza di 4 mm polvere di cristallo DHT (lunghezza totale di pellet è di 8mm). Questo modello produce livelli DHT del siero che sono circa 2 volte superiore (denominato 2xDHT) di quella dei topi di controllo senza trattamento DHT. I topi di 2xDHT non presentano alterazioni di basale del siero, testosterone, LH e non sviluppare l’obesità e mostrare peso ovarico simile, i livelli sierici di colesterolo, acidi grassi liberi, leptina, TNFα e IL-623,24, 25 relativi a controlli anche fino a 3,5 mesi dopo DHT inserimento23,24,25. Inoltre, con l’accoppiamento le femmine che hanno già sviluppato caratteristiche di PCOS, possiamo studiare l’impatto di un ambiente materno iperandrogenica sulla salute metabolica e riproduttiva della prole15.

Questo nuovo paradigma (pertinente ai criteri NIH e società AE-PCOS) modella la malattia producendo relativamente simili livelli di androgeni a quelli delle donne con PCOS 2 – 3 volte più alto testosterone o i livelli di DHT rispetto alle donne inalterate. Tuttavia, questo modello è garantito dal continuo DHT esogeno e non da iperandrogenismo endogeno programmato una volta DHT è ritirato. L’obiettivo generale di questo articolo è di concentrarsi su 1) come fare il pellet DHT; 2) come generare un lean-PCOS come modello murino; 3) strategie per valutare la prole femminile da queste dighe. Altre misure e la valutazione di fenotipi non vengono affrontati in questo manoscritto, ma possono essere trovati in5,15,23,24,25,26.

Protocol

Qui, presentiamo protocolli dettagliati per inserimento e DHT pellet preparazione e per test riproduttivi e metabolici. I topi utilizzati in questo studio erano un fondo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e sono stati mantenuti con cibo e acqua ad libitum in un ciclo luce/buio 14/10 h a 24 ° C nella struttura animale Broadway Research Building presso la Johns Hopkins University School of Medicina. Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali di Johns Hopkins University. <p class=…

Representative Results

Livelli sierici di DHT e test di tolleranza al glucosio I livelli di DHT sono stati misurati dal siero raccolto da entrambi ELISA e mediante LC-MS secondo protocollo 1,24-1,25 e 2.9, 3.0. I valori assoluti DHT sono diversi tra spettrometria di massa ed ELISA, tuttavia, la relativa piega (circa 2 volte) di DHT vs no-DHT inserimento è simile in entrambe le analisi e attraverso esperimenti15,<sup cl…

Discussion

Iperandrogenismo è una caratteristica fondamentale di PCOS. I livelli del siero DHT (due volte più alto nei topi DHT che nei topi no-DHT) utilizzati in questo protocollo sono inferiori a quelli riportati da altri ricercatori in studi precedenti e sono calibrati per imitare proporzionalmente le donne con PCOS5,19, 20,21. A differenza di altri modelli, questo modello DHT 2 volte non altera il …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (sovvenzioni R00-HD068130 a S.W.) e il centro di ricerca del diabete di Baltimora: piloti e fattibilità Grant (a S.W.).

Materials

Crystalline 5α-DHT powder   Sigma-Aldrich A8380-1G
Dow Corning Silastic tubing Fisher Scientific 11-189-15D 0.04in/1mm inner diameter x0.085in/2.15mm outer diameter
Medical adhesive silicone  Factor II, InC.  A-100
Goggles, lab coats, gloves and masks.
 10 µL pipette tips without filter USA Scientific 11113700
Microscope slide for smear Fisher Scientific 12-550-003
Diff Quik for staining cells Fisher Scientific NC9979740
  Lancet Fisher Scientific NC9416572
3 mL Syring  Becton, Dickinson and Company (BD), 30985
 attached needle: 20G BD 305176
 Ruler: any length than 10cm with milimeter scale. 
Xylazine  Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise NDC13985-704-10 100mg/ml
Ketamine Hydrochloride Hospira, Inc NDC 0409-2051-05 100mg/ml
 Surgical staple  AutoClip® System, Fine Science Tool 12020-00
 Insulin syringe BD 329461 1/2 CC, low dose U-100 insulin syringe
 Trochar  Innovative Research of America MP-182
Microscope Carl Zeiss Primo Star 415500-0010-001 Germany
Ear punch Fisher Scientific 13-812-201
Testosterone rat/mouse ELISA kit IBL B79174
DHT ELISA kit Alpha Diagnostic International 1940
One touch ultra glucometer Life Scan, Inc.
One touch ultra test stripes Life Scan, Inc.
Eppendorf tube Fisher Scientific 05-402-18
Razor blade Fisher Scientific 12-640
Clidox Fisher Scientific NC0089321
surgical underpad Fisher Scientific 50587953 Supplier Diversity Partner
Manufacturer:  Andwin Scientific 56616018
Betadine Antiseptic Solution Walgreens
3M Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) 3M Science. Applied to Life
Animal tattoo ink paste Ketchum manufacturing Inc. Brockville, Ontario, Canada
Scale Ohaus Corporation  HH120D Pine Brook, NJ
Electronic digital caliper NEIKO Tools USA 01407A available from Amazon

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Xue, P., Wang, Z., Fu, X., Wang, J., Punchhi, G., Wolfe, A., Wu, S. A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome. J. Vis. Exp. (140), e58379, doi:10.3791/58379 (2018).

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