Imagerie en temps réel et la Quantification du développement de biofilms fongiques en utilisant un système de flux de recirculation en deux phases
Summary
Nous décrivons le montage, exploitation, et le nettoyage d’un appareil à débit conçu pour la formation de biofilms fongiques d’image en temps réel sous flux. Nous également fournissons et discuter des algorithmes quantitatifs pour être utilisé sur les images acquises.
Abstract
Dans la candidose oropharyngée, les membres du genre Candida doivent respecter et se développent sur la surface de la muqueuse buccale, sous l’effet du flux salivaire. Tandis que les modèles de croissance sous flux ont été développés, beaucoup de ces systèmes sont chers, ou ne permettent pas d’imagerie tandis que les cellules sont sous flux. Nous avons développé un appareil novateur qui permet à l’image de la croissance et le développement des cellules de Candida albicans sous flux et en temps réel. Ici, nous détaillons le protocole pour le montage et l’utilisation de cet appareil de flux, ainsi que la quantification des données qui sont générées. Nous sommes en mesure de quantifier les taux que les cellules attachent à et se détachent de la diapositive, ainsi que pour déterminer une mesure de la biomasse sur la diapositive au fil du temps. Ce système est économique et polyvalent, travaillant avec nombreux types de microscopes légers, y compris les microscopes portatifs peu coûteux, et est capable d’étendue d’imagerie fois par rapport aux autres systèmes de flux. Dans l’ensemble, il s’agit d’un système de faible débit qui peut fournir des informations en temps réel très détaillées sur la croissance de biofilm des espèces fongiques sous flux.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) est un champignon pathogène opportuniste des humains qui peuvent infecter de nombreux types de tissus, y compris les muqueuses orales, causant la candidose oropharyngée et résultant en une plus faible qualité de vie pour les personnes concernées1. La formation de biofilm est une caractéristique importante de la pathogenèse de c. albicanset de nombreuses études ont été faites sur la formation et la fonction de c. albicans biofilms2,3,4, 5, dont beaucoup ont été réalisées à l’aide de statique (pas de débit) in vitro des modèles. Cependant, c. albicans doivent adhérer et se développer en présence de flux salivaire dans la cavité buccale. Nombreux systèmes d’écoulement ont été développées pour permettre de vivre-cellule d’imagerie6,7,8,9,10. Ces systèmes de flux différents ont été conçus à des fins différentes, et donc chaque système possède différentes forces et faiblesses. Nous avons constaté que beaucoup de l’écoulement des systèmes appropriés pour c. albicans étaient coûteux, complexe requis fabriqué des pièces, ou pourrait être pas photographié au cours de l’écoulement et a dû être arrêté avant l’imagerie. Par conséquent, nous avons développé un appareil de nouveaux flux pour étudier la formation de biofilm de c. albicans sous flux11. Lors de la conception de nos appareils de débit, nous avons suivi ces considérations principales. Tout d’abord, nous voulions être en mesure de quantifier les multiples aspects de la croissance de biofilm et le développement en temps réel sans nécessiter l’utilisation de cellules fluorescentes (nous permettant d’étude souches mutantes et isolats cliniques non modifiées facilement). Deuxièmement, nous voulions que toutes les parties à être commercialisé avec peu ou aucune modification (i.e., aucune fabrication sur mesure), permettant à d’autres plus facilement recréer notre système et la possibilité pour des réparations faciles. En troisième lieu, nous voulions également permettre prolongée d’imagerie fois à raisonnablement des débits élevés. Enfin, nous avons voulu, après une période de cellules fixation au substrat sous flux, pour pouvoir surveiller la croissance de biofilm après un certain temps sans introduire de nouvelles cellules.
Ces considérations nous conduisent à développer le système d’écoulement recirculation deux-flacon illustré à la Figure 1. Les deux ballons nous permettent de partager l’expérience en deux phases, une phase d’attachement qui puise dans la fiole d’attachement cellulaire graines et une phase de croissance qui utilise les médias acellulaire pour poursuivre la croissance de biofilm sans l’ajout de nouvelles cellules. Ce système est conçu pour fonctionner avec une chambre d’incubation pour le microscope, avec le toboggan et le tube qui le précède (de 2 à 5, Figure 1) étant placé à l’intérieur de l’incubateur, et tous les autres composants placés dans un grand récipient secondaire à l’extérieur de la microscope. En outre, un agitateur de plaque chauffante avec une sonde de température ci-jointe est utilisé pour maintenir les cellules fongiques dans la fiole de pièce jointe à 37 ° C. Comme c’est le recyclage, ce système est capable de l’imagerie continue au cours de l’écoulement (peut être plus de 36 h selon les conditions) et peut être utilisé sur la plupart des microscopes, y compris les microscopes de benchtop inversé ou dressées. Ici, nous discutons de la montage, exploitation, et nettoyage de l’appareil à flux, tout en fournissant certains algorithmes quantitatives de base ImageJ pour analyser les vidéos après une expérience.
Protocol
Representative Results
Discussion
En utilisant le système d’écoulement décrites ci-dessus permet la génération de vidéos time-lapse quantitatives des biofilms fongiques croissance et le développement. Pour permettre la comparaison entre les expériences, c’est d’une importance cruciale pour s’assurer que les paramètres d’imagerie restent les mêmes. Cela inclut de veiller à ce que le microscope est mis en place pour l’éclairage de Köhler pour chacune des expériences (de nombreux guides sont disponibles en ligne pour ce processus)….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs aimerait Dr Wade Sigurdson pour apporter une contribution précieuse dans la conception de l’appareil à flux.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
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