Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi
Summary
Biz derleme işlemi, tarif ve gerçek zamanlı akış iken altında görüntü mantar biyofilm oluşumu için bir akış cihazları temizlik tasarlanmış. Biz de sağlamak ve elde edilen görüntülerde kullanılmak üzere sayısal algoritmalar tartışıyorlar.
Abstract
Oropharyngeal kandidiyazis içinde Candida cinsinin üyeleri uygun ve süre tükürük akışı etkileri altında oral mukozal yüzeyinde büyümek gerekir. Akış altında büyüme modellerinde geliştirilmiş olsa da, bu sistemlerin pek çok pahalı veya hücreleri akış altında iken görüntüleme izin vermiyor. Büyüme ve gelişme Candida albicans hücre akışı altında ve gerçek zamanlı görüntü için bize izin verir yeni bir cihaz geliştirdik. Burada, derleme ve bu akışı cihaz kullanımı yanı sıra oluşturulan veri miktar için protokolü ayrıntılı. Biz bu hücreleri ekleyin ve slayttan slayt üzerinde biyokütle ölçüsü zaman içinde belirlemek için, de ayırmak oranları ölçmek edebiliyoruz. Ve bu sistem hem ekonomik hem çok yönlü, ışık mikroskoplar, ucuz benchtop mikroskoplar, dahil olmak üzere birçok türleri ile çalışma yeteneğine sahip olan diğer akış sistemlerine göre kez Imaging genişletilir. Genel olarak, bu son derece ayrıntılı gerçek zamanlı bilgi akışı altında mantar türlerinin biyofilm büyüme sağlayabilen bir düşük işlem hacmi sistemdir.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) bir fırsatçı mantar patojen oral mukozal yüzeyler de dahil olmak üzere, oropharyngeal kandidiyazis neden ve daha düşük bir yaşam kalitesi için etkilenen bireylerin1sonuçlanan birçok doku türler, enfekte olabilir insanlar var. Biyofilm oluşumu için C. albicanspatogenezinde önemli bir özelliğidir ve oluşumu ve işlev C. albicans biyofilmler2,3,4çok sayıda çalışma yapılmıştır, 5birçoğu gerçekleştirdik statik (akımı) vitro kullanarak, modelleri. Ancak, C. albicans uygun ve ağız boşluğu tükürük akışında huzurunda büyümek gerekir. Çok sayıda akış sistemleri canlı hücre görüntüleme6,7,8,9,10için izin vermek için geliştirilmiştir. Bu farklı akış sistemleri farklı amaçlar için tasarlanmıştır ve bu nedenle her sistem farklı güçlü ve zayıf yönleri vardır. Bulduk çok akış sistemleri C. albicans için uygun maliyetli, gerekli karmaşık parçaları, fabrikasyon veya değil olabilir akışı sırasında yansıma ve görüntüleme önce durdurulması gerekiyordu. Bu nedenle, C. albicans biyofilm oluşumu akışı11altında çalışmaya bir roman akışı aparatı geliştirdik. Akış cihazlarımızı tasarım sırasında bu önemli konuları takip ettik. İlk olarak, biyofilm büyüme ve gelişme içinde birden çok yönlerini ölçmek mümkün istedim floresan hücreleri (bize çalışma mutant suşları ve değiştirilmemiş klinik yalıtır kolayca izin) kullanımı gerektiren olmadan gerçek zamanlı. İkinci olarak, biz hiçbir değişiklik için çok az ile ticari olarak kullanılabilir olması için tüm parçaları istedim (i.e., hiçbir özel imalat), diğerleri daha kolayca sistemimiz yeniden sağlayan ve kolay onarımlar için izin. Üçüncü olarak, aynı zamanda genişletilmiş için izin istedim zaman makul yüksek akış oranları görüntüleme. Son olarak, döneminden sonra hücre yüzey akışı altında için ekleme bir genişletilmiş bir zaman içinde biyofilm büyüme yeni hücre tanıtımı olmadan izlemek edebilmek için istedik.
Bunu göz önünde iki şişeye dolaşım akış sistemi Şekil 1‘ de gösterildiği geliştirmek için bize yol. İki şişe deney iki aşama, hücre numaralı seribaşı eki balonun çizer bir eki faz ve biyofilm büyüme yeni hücreler ek olmadan devam etmek için medya boş hücre kullanır bir büyüme aşamasında içine bölmek sağlamak. Bu sistem (2-5 Şekil 1) inkübatör içinde konuyor kendisinden önce boru ve slayt ile mikroskop için bir kuluçka odası ile çalışacak şekilde tasarlanmıştır ve tüm diğer bileşenleri yerleştirilen dışında büyük bir ikincil kap içinde mikroskop. Ayrıca, bir Pinar karıştırıcı bir ekli sıcaklık probu ile 37 ° C’de eki şişeyi mantar hücreleri korumak için kullanılır Sirkülasyon gibi bu sistem (36 h üzerinden koşullara bağlı olarak olabilir) akışı sırasında sürekli görüntüleme yeteneğine sahiptir ve dik veya ters benchtop mikroskoplar dahil olmak üzere çoğu standart mikroskoplar kullanılabilir. Burada, biz derleme işlemi, ele ve akış aparatı temizlik, de gibi videoları bir deneyden sonra analiz etmek için bazı temel ImageJ nicel algoritmalar sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Akış sistemi kullanarak yukarıda belirtildiği gibi nicel hızlandırılmış videoları mantar biyofilm büyüme ve gelişme üretimi için izin verir. Deneyler arasında karşılaştırmalar için izin vermek için görüntüleme parametreleri aynı kalmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bu mikroskop için Köhler aydınlatma (birçok kılavuzları online Bu işlem için kullanılabilir) her deneme için ayarlanır sağlanması içerir. Parametreleri görüntüleme bir yana, akış aparatı ile çalış…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr. Wade Sigurdson değerli giriş akışı aparat tasarımı sağlamak için kabul etmek istiyorum.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
