Real-time Imaging en kwantificering van schimmel Biofilm ontwikkeling met behulp van een bewerking in twee fasen recirculatie-stroomsysteem
Summary
We beschrijven de vergadering, operatie, en schoonmaken van een apparaat van de stroom ontworpen om schimmel biofilm beeldvorming in real-time terwijl onder stroom. Wij bieden ook en bespreken van kwantitatieve algoritmen worden gebruikt op de verworven beelden.
Abstract
In orofaryngeale candidiasis, moeten leden van het geslacht Candida zich houden aan en groeien op de mondelinge mucosal oppervlakte terwijl onder de gevolgen van speeksel stroom. Terwijl de modellen voor de groei onder stroom hebben ontwikkeld, veel van deze systemen zijn duur, of niet toestaan imaging terwijl de cellen onder stroom. We hebben een nieuw apparaat dat ons toelaat om de groei en de ontwikkeling van Candida albicans cellen onder stroom en in real-time beeld ontwikkeld. Hier, detail we het protocol voor de vergadering en het gebruik van dit apparaat van de stroom, evenals het kwantificeren van gegevens die worden gegenereerd. We kunnen de tarieven die de cellen koppelen aan en loskoppelen van de dia, evenals over het bepalen van een maatregel van de biomassa op de dia na verloop van tijd kwantificeren. Dit systeem is zowel economische als veelzijdig, werken met vele soorten licht microscopen, met inbegrip van goedkope benchtop microscopen, en staat uitgebreid imaging keer in vergelijking met andere systemen van stroom. Globaal, dit is een laag-doorvoer systeem dat zeer gedetailleerde real-time informatie over de groei van de biofilm van schimmel soorten onder stroom verschaffen kan.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) is een opportunistische schimmel pathogeen voor mensen die veel weefselsoorten, met inbegrip van mondelinge mucosal oppervlakken, orofaryngeale candidiasis veroorzaakt en wat resulteert in een lagere kwaliteit van leven voor beïnvloede individuen1kan infecteren. Biofilm vorming is een belangrijk kenmerk voor de pathogenese van C. albicans, en talrijke studies zijn gedaan over de vorming en de functie van C. albicans biofilms2,3,4, 5, waarvan vele zijn uitgevoerd met behulp van statische (geen stroom) in vitro modellen. C. albicans moet echter houden en groeien in aanwezigheid van speeksel stroming in de mondholte. Talrijke stroom systemen zijn ontwikkeld om te voorzien in live-cel imaging6,7,8,9,10. Deze verschillende stroom-systemen zijn ontworpen voor verschillende doeleinden, en daarom elk systeem heeft verschillende sterke en zwakke punten. Vonden wij dat veel van de stroom systemen geschikt zijn voor C. albicans waren duur, vereiste complex vervaardigde onderdelen, of kon niet worden beeld tijdens stroom en moest worden gestopt voordat de beeldvorming. Daarom ontwikkelden we een nieuwe stroom apparaat om te studeren C. albicans biofilm vorming onder stroom11. Tijdens het ontwerp van onze apparaten van de stroom, wij gevolgd deze belangrijke overwegingen. Ten eerste, we wilden kunnen kwantificeren van meerdere aspecten van de biofilm groei en ontwikkeling in real-time zonder het gebruik van fluorescerende cellen (toelatend ons aan studie gemuteerde stammen en ongewijzigde klinische isolaten gemakkelijk). Ten tweede wilden we alle onderdelen om commercieel beschikbaar met weinig tot geen wijzigingen (dwz., geen aangepaste fabricage), zodat anderen meer gemakkelijk opnieuw ons systeem en waardoor voor eenvoudige reparaties. Ten derde, we wilden ook toestaan voor uitgebreide imaging keer op redelijk hoog debiet. Tot slot, we wilden, na een periode van cellen verbonden zijn aan het substraat onder stroom, kunnen controleren de biofilm groei gedurende een langere tijd zonder de invoering van nieuwe cellen.
Deze overwegingen leidde ons naar het ontwikkelen van het twee-kolf recirculatie-stroomsysteem geïllustreerd in Figuur 1. De beide kolven kunnen we het experiment in twee fasen, de fase van een bijlage die uit de cel-geplaatste bijlage kolf trekt en een groeifase waarbij de cel-vrije media om te blijven de biofilm groei zonder de toevoeging van nieuwe cellen splitsen. Dit systeem is ontworpen om te werken met een incubatie kamer voor de Microscoop, waarbij de dia en de slang voorafgaand aan het (2 tot en met 5, Figuur 1) wordt geplaatst in de incubator, en alle andere onderdelen geplaatst in een grote secundaire container buiten de Microscoop. Een kookplaat roerder met een bijgevoegde temperatuursonde wordt bovendien gebruikt om schimmel cellen in de kolf van de bijlage bij 37 ° C. Zoals het opnieuw circuleren is, dit systeem is geschikt voor continue imaging tijdens stroom (kan worden meer dan 36 h afhankelijk van omstandigheden), en kan worden gebruikt op de meeste standaard microscopen, met inbegrip van rechte of omgekeerde benchtop microscopen. Hier bespreken we de vergadering, operatie, en schoonmaken van het apparaat van stroom, ook als bieden sommige fundamentele ImageJ kwantitatieve algoritmen voor het analyseren van de video’s na een experiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van de stroomsysteem zorgt zoals hierboven beschreven voor de generatie van kwantitatieve time-lapse video’s van schimmel biofilm groei en ontwikkeling. Als u wilt toestaan voor vergelijkingen tussen experimenten is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat de imaging parameters hetzelfde blijven. Het is hierbij om ervoor te zorgen dat de Microscoop is ingesteld voor Köhler verlichting voor elk experiment (vele gidsen zijn online beschikbaar voor dit proces). Naast de imaging parameters, zijn er enkele bel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs wil erkennen van Dr. Wade Sigurdson voor het verstrekken van waardevolle inbreng in het ontwerp van het apparaat van de stroom.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
