Imaging in tempo reale e quantificazione dello sviluppo di Biofilm fungine utilizza un sistema bifase di flusso a ricircolo
Summary
Descriviamo l’assembly, operazione, e la pulizia di un apparato di flusso progettato per formazione di biofilm fungine di immagine in tempo reale mentre sotto flusso. Inoltre forniamo e discutere algoritmi quantitativi da utilizzare sulle immagini acquisite.
Abstract
Nella candidosi orofaringea, membri del genere Candida devono rispettare e crescere sulla superficie mucosa orale mentre sotto gli effetti del flusso salivare. Mentre sono stati sviluppati modelli per la crescita sotto flusso, molti di questi sistemi sono costosi, o non consentire mentre le cellule sono sotto flusso di imaging. Abbiamo sviluppato un apparato romanzo che ci permette di immagine la crescita e lo sviluppo delle cellule di Candida albicans in flusso e in tempo reale. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo per il montaggio e l’uso di questo apparato di flusso, così come la quantificazione dei dati generati. Siamo in grado di quantificare le tariffe che le cellule collegare e staccano dalla diapositiva, come pure di determinare una misura della biomassa sulla diapositiva nel corso del tempo. Questo sistema sia economico e versatile, lavorando con molti tipi di microscopi ottici, compresi microscopi benchtop poco costoso, ed è in grado di estesa volte rispetto ad altri sistemi di flusso di imaging. Nel complesso, questo è un sistema di bassa produttività che può fornire informazioni in tempo reale altamente dettagliate sulla crescita di biofilm delle specie fungine sotto flusso.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) è un agente patogeno fungoso opportunistico degli esseri umani che possono infettare molti tipi di tessuto, comprese le superfici mucose orale, causando la candidosi orofaringea e conseguente a una minore qualità della vita per individui affetti1. Formazione di biofilm è una caratteristica importante per la patogenesi di albicans del c., e numerosi studi sono stati fatti sulla formazione e sulla funzione di c. albicans biofilms2,3,4, 5, molti dei quali sono stati eseguiti utilizzando statico (nessun flusso) in vitro modelli. Tuttavia, c. albicans deve aderire e crescere in presenza di flusso salivare nella cavità orale. Numerosi sistemi di flusso sono stati sviluppati per consentire per vivere-cella imaging6,7,8,9,10. Questi sistemi di flusso differenti sono stati progettati per scopi diversi, e quindi ogni sistema ha diversi punti di forza e debolezze. Abbiamo trovato che molti del flusso sistemi appropriati per albicans del c. erano costose, richiesto complesso fabbricato parti, o non potrebbe essere imaged durante flusso e doveva essere fermato prima di formazione immagine. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un apparato di flusso romanzo per studiare la formazione di biofilm di albicans del c. sotto flusso11. Durante la progettazione del nostro apparato di flusso, abbiamo seguito queste considerazioni principali. In primo luogo, abbiamo voluto essere in grado di quantificare gli aspetti multipli della crescita di biofilm e sviluppo in tempo reale senza richiedere l’uso di cellule fluorescenti (permettendoci di ceppi mutanti di studio e gli isolati clinici non modificati facilmente). In secondo luogo, volevamo tutte le parti per essere commercialmente disponibile con poca o nessuna modifica (cioè., nessun montaggio su ordinazione), consentendo ad altri di più facilmente ricreare il nostro sistema e per riparazioni semplici. In terzo luogo, abbiamo anche voluto consentire per esteso volte al prezzo ragionevolmente elevato flusso di imaging. Infine, abbiamo voluto, dopo un periodo di cellule allegare al substrato sotto flusso, essere in grado di monitorare la crescita di biofilm nel corso di un periodo prolungato senza introdurre nuove cellule.
Queste considerazioni hanno portato a sviluppare il sistema di flusso a ricircolo due-boccetta illustrato nella Figura 1. Due boccette ci permettono di dividere l’esperimento in due fasi, una fase di attaccamento che attinge il matraccio di cella-seminato allegato e una fase di crescita che utilizza mezzi senza cellula per continuare la crescita di biofilm senza l’aggiunta di nuove cellule. Questo sistema è progettato per funzionare con una camera di incubazione per il microscopio, con lo scivolo e il tubo che lo precede (2 a 5, Figura 1) essere collocato all’interno dell’incubatore, e tutti gli altri componenti collocati in un grande contenitore secondario di fuori del microscopio. Inoltre, un agitatore di piastra riscaldante con una sonda di temperatura collegata viene utilizzato per mantenere le cellule fungine nella beuta di attaccamento a 37 ° C. Come esso è a ricircolo, questo sistema è in grado di imaging continuo durante il flusso (può essere oltre 36 h a seconda di condizioni) e può essere utilizzato sulla maggior parte dei microscopi, tra cui microscopi da banco verticale o invertito. Qui, discutiamo l’assembly, operazione, e pulizia dell’apparato di flusso, oltre a fornire alcuni algoritmi quantitativi di base ImageJ per analizzare i video dopo un esperimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando il sistema di flusso come indicato in precedenza consente la generazione di video time-lapse quantitativi della crescita di biofilm fungine e dello sviluppo. Per consentire il confronto tra esperimenti è di importanza critica per garantire che i parametri di imaging vengono mantenuti lo stesso. Ciò include garantire che il microscopio è impostato per l’illuminazione di Köhler per ogni esperimento (molte guide sono disponibili online per questo processo). Oltre a parametri di imaging, ci sono alcuni passi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare Dr. Wade Sigurdson per fornire un input prezioso nella progettazione dell’apparato di flusso.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
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