실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화
Summary
어셈블리, 동작, 설명 그리고 흐름에서 실시간으로에서 이미지 균 biofilm 형성 하도록 설계 흐름 기구의 청소. 우리는 또한 제공 하 고 인수 이미지에 사용할 수 양적 알고리즘 토론.
Abstract
Oropharyngeal 칸디 다에서 칸디 다 속의 멤버 준수 하 고 침 흐름의 영향 아래 구두 점 막 표면에 성장 해야 합니다. 흐름에서 성장에 대 한 모델을 개발 하는 동안 이러한 시스템의 대부분, 또는 이미징 동안 셀 흐름에서 허용 하지 않습니다. 우리는 우리가 성장과 개발 흐름에서 실시간으로 칸디 다 albicans 셀의 이미지를 새로운 기구를 개발 했습니다. 여기, 우리 선발 어셈블리 및이 흐름 장치의 사용 뿐만 아니라 생성 되는 데이터의 정량화에 대 한 프로토콜. 우리 세포를 연결 하 고 슬라이드 뿐만 아니라 슬라이드에 바이오 매스의 측정 시간이 지남에 확인할에서 분리 속도 정할 수 있습니다. 이 시스템은 경제적이 고 다재 다능 한, 저렴 한 벤치탑 현미경를 포함 하 여 가벼운 현미경의 많은 종류 및 수 있는 확장 이미징 다른 흐름 시스템에 비해 시간. 전반적으로, 이것은 낮은 처리량 시스템 biofilm 성장의 흐름에서 곰 팡이 종에 매우 상세한 실시간 정보를 제공할 수 있는.
Introduction
Candida albicans (C. albicans)은 인간의 많은 조직 유형, 구강 점 막 표면을 포함 하 여, oropharyngeal 칸디 다 증을 일으키는 원인이 되 고 영향을 받는 개인1대 한 생명의 낮은 품질의 결과 감염 시킬 수 있는 기회 곰 팡이 병원 체 이다. C. albicans의 병 인에 대 한 중요 한 특성은 Biofilm 형성 및 형성과 C. albicans biofilms2,3,4,의 기능에 다 수의 연구 수행 되었습니다. 5, 생체 외에서 정적 (흐름)를 사용 하 여 실시 되어 많은 모델. 그러나, C. albicans 는 준수 하 고 구강에 타 액 흐름의 면 전에 서 성장 해야 합니다. 수많은 흐름 시스템 라이브 셀 이미징6,7,8,,910수 있도록 개발 되었습니다. 이러한 다른 흐름 시스템 다른 목적을 위해 설계 되었습니다 그리고 그러므로 각 시스템에 서로 다른 강점과 약점. 우리는 C. albicans 에 대 한 적절 한 시스템 흐름의 많은 비용이 많이 드는 했다, 필요한 복잡 한 부품, 조작 또는 하지 될 수 흐름 중 몇 군데와 이미징 이전 중지 했다 발견. 따라서, 우리는 흐름 제11 C. albicans biofilm 형성 연구에 새로운 흐름 장치를 개발 했다. 우리의 흐름 장치 설계, 동안 우리는 이러한 주요 고려 사항을 따라. 첫째, 우리 biofilm 성장과 발전의 여러 측면을 계량 수 싶 었 어 요 (수 있도록 우리 연구 돌연변이 체 긴장 및 수정 되지 않은 임상 분리를 쉽게) 형광 세포의 사용을 요구 하지 않고 실시간. 둘째, 우리가 원하는 모든 부분을 거의 수정 없이 상업적으로 사용할 수 (즉., 아니 주문 제작), 다른 더 쉽게 우리의 시스템을 다시 만들 수 있도록 하 고 쉽게 수리에 대 한 허용. 셋째, 우리 또한 하 고 싶 었 확장 수 있도록 합리적으로 높은 흐름 율에 이미징. 마지막으로, 우리 싶어, 흐름, 아래 기판에 연결 하는 셀의 기간 뒤에 새로운 셀을 도입 하지 않고 오랜된 시간 동안 biofilm 성장을 모니터 할 수 있을.
이러한 고려 사항 지도 그림 1에 나와 있는 2 플라스 크 반복 흐름 시스템을 개발 했다. 두 개의 플라스 크 2 단계, 셀 시드 첨부 플라스 크에서 그리는 첨부 파일 단계와 성장 단계를 사용 하 여 셀 무료 미디어 새로운 셀의 추가 없이 biofilm 성장을 계속 실험을 분할 수 있습니다. 이 시스템은 앞 (2 ~ 5, 그림 1), 인큐베이터 안에 배치 되 고 튜브 슬라이드와 현미경에 대 한 보육 챔버와 함께 작동 하도록 설계 하 고 밖에 서 큰 보조 컨테이너에서 다른 모든 구성 요소 배치는 현미경입니다. 또한, 연결 된 온도 프로브 열판 활동가 37 ° c.에 첨부 플라스 크에 균 세포를 유지 하기 위해 사용 됩니다. 재순환은이 시스템은 지속적인 영상 흐름 (36 h 이상의 조건에 따라 일 수 있다), 중 고 직 립 또는 거꾸로 벤치탑 현미경을 포함 하 여 대부분의 표준 현미경에 사용 될 수 있습니다. 여기, 우리 어셈블리, 작업, 토론 고 흐름 기구의 청소 뿐만 몇 가지 기본적인 ImageJ 양적 알고리즘 실험 후 비디오 분석을 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
흐름 시스템을 사용 하 여 위에서 설명한 대로 균 biofilm 성장과 개발의 양적 시간 경과 비디오의 생성에 대 한 수 있습니다. 비교 실험에 대 한 수 있도록 그것 이미징 매개 변수는 같은 유지 되도록 중요 한 중요성 이다. 현미경 (많은 가이드 온라인 사용할 수 있습니다이 프로세스에 대 한) 각 실험에 대 한 쾰러 조명에 대 한 설정 되어 보장 포함 됩니다. 매개 변수, 이미징 제외 흐름 장치를 작업?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 흐름 장치의 디자인에서 중요 한 입력을 제공 하기 위한 박사 웨이드 Sigurdson를 인정 하 고 싶습니다.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
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