Sanntid bildebehandling og kvantifisering av sopp Biofilm utvikling bruker en tofaset resirkulerende med System
Summary
Vi beskriver forsamlingen, drift, og rengjøring av en flyt apparater utformet bilde fungal biofilm formasjonen i sanntid under flyt. Vi gir og diskutere kvantitative algoritmer som skal brukes på ervervet bildene.
Abstract
I orofaryngeal candidiasis, må medlemmer av slekten Candida overholde og vokse på muntlig slimhinnen mens under effekter av salivary flyt. Mens modeller for vekst under flyt er utviklet, mange av disse systemene er dyre, eller tillater ikke tenkelig mens cellene er under flyt. Vi har utviklet en roman apparater som tillater oss å image vekst og utvikling av Candida albicans celler under flyt og i sanntid. Her detalj vi protokollen for samling og bruk av flyt apparatet og kvantifiseringen som genereres. Vi er kunne kvantifisere priser som cellene koble til og koble fra lysbildet, samt å finne et mål av biomasse på lysbildet over tid. Dette systemet er både økonomisk og allsidig, arbeider med mange typer lys mikroskoper, inkludert rimelige Borstemmaskin mikroskoper, og er i stand til forlenget imaging ganger sammenlignet med andre flyt systemer. Samlet er dette en lav gjennomstrømming system som kan gi svært detaljert sanntidsinformasjon om biofilm veksten av sopp arter under flyt.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) er en opportunistisk fungal patogen mennesker som kan infisere mange vev typer, inkludert muntlige mucosal flater, forårsaker orofaryngeal candidiasis og resulterer i en lavere livskvalitet for berørte personer1. Biofilm formasjon er et viktig karakteristisk for patogenesen av C. albicansog flere studier er gjort på dannelsen og funksjon av C. albicans biofilm2,3,4, 5, hvorav mange har blitt utført ved hjelp av statisk (ingen flyt) i vitro modeller. C. albicans må imidlertid følge og vokse i nærvær av salivary flyt i munnhulen. Mange strøm systemer er utviklet for å gi live-celle tenkelig6,7,8,9,10. Disse forskjellige strømnings systemene er designet for ulike formål, og derfor har systemet forskjellige styrker og svakheter. Vi fant at mange av systemene passer for C. albicans var dyrt, nødvendige komplekse fabrikert deler, eller kunne ikke fotografert under flyt og måtte stoppes før bildebehandling. Derfor utviklet vi en roman flyt apparater å studere C. albicans biofilm formasjon under flyt11. Under utformingen av vår flyt apparater fulgte vi disse store betraktninger. Først ønsket vi å kunne kvantifisere flere aspekter av biofilm vekst og utvikling i sanntid uten å bruke fluorescerende celler (tillater oss å studere mutant stammer og uforandret kliniske isolater lett). Andre vi ønsket alle deler å bli kommersielt anvendelig med liten eller ingen modifikasjoner (dvs., ingen egendefinerte fabrikasjon), slik at andre mer enkelt gjenopprette systemet og muliggjør enkle reparasjoner. Tredje vi ønsket også å tillate for utvidet imaging tid rimelig høy flow priser. Til slutt, vi ville, etter en periode av celler vedlegges underlaget under flyt, kunne overvåke biofilm vekst over lengre tid uten å innføre nye celler.
Disse betraktningene førte oss til å utvikle to-kolbe resirkulerende flyt systemet illustrert i figur 1. De to flasker tillate oss å dele eksperimentet i to faser, en vedlegg-fase som trekker fra celle-seeded vedlegg kolbe og en vekstfase som bruker celle-frie medier for å fortsette biofilm veksten uten tilsetning av nye celler. Dette systemet er utviklet for å fungere med en inkubasjon kammer til mikroskopet, med lysbildet og slangen før (2 til 5, figur 1) å være plassert inne inkubator, og alle andre komponenter plassert i en stor sekundære container utenfor det mikroskop. I tillegg brukes en kokeplate rørestang med en vedlagt temperatur probe til å vedlikeholde fungal cellene i vedlegg flasken på 37 ° C. Som det er resirkulering, dette systemet er i stand til kontinuerlig imaging under flyt (kan være over 36 h avhengig forhold), og kan brukes på de fleste standard mikroskoper, inkludert stående eller omvendt Borstemmaskin mikroskop. Her diskuterer vi forsamlingen, drift, og rengjøring av flyt apparater, samt som gir noen grunnleggende ImageJ kvantitative algoritmer å analysere videoene etter et eksperiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av flyt systemet tillater som beskrevet ovenfor generering av kvantitative time-lapse videoer av sopp biofilm vekst og utvikling. Slik at sammenligninger mellom eksperimenter er det av kritisk betydning for å sikre at parameterne tenkelig forblir de samme. Dette inkluderer å sikre at mikroskopet er konfigurert for Köhler belysning for hvert eksperiment (mange guider er tilgjengelig online for denne prosessen). Bortsett fra imaging parametere, er det noen viktige trinn du bør huske på når du arbeider med f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Wade Sigurdson for å gi verdifulle innspill i utformingen av flyt apparatet.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
