В реальном времени обработки изображений и количественная оценка развития грибковых биопленки, с использованием двухфазной системы рециркуляции потока
Summary
Мы описываем Ассамблея, операции, и очистки потока аппарата предназначена для грибковых биопленки изображения в режиме реального времени под потока. Мы также представить и обсудить количественных алгоритмы для использования на приобретенные изображения.
Abstract
В Ротоглоточный кандидоз члены рода Candida должны придерживаться и растут на устные слизистой поверхности находясь под воздействием слюны. Хотя были разработаны модели для роста под потока, многие из этих систем являются дорогими, или не позволяют изображений в то время как клетки находятся под потока. Мы разработали новый аппарат, который позволяет нам изображения рост и развитие клеток Candida albicans под потока и в режиме реального времени. Здесь мы подробно протокол для Ассамблеи и использование этого аппарата потока, а также количественная оценка данных, которые создаются. Мы в состоянии дать количественную оценку ставок, которые клетки придают и отсоединить от слайдов, а также определить меру биомассы на слайде с течением времени. Эта система является экономичным и универсальный, работают со многими типами света Микроскопы, включая недорогие benchtop Микроскопы, и способный распространяется изображений раза по сравнению с другими системами потока. В целом это низкая пропускная система, которая может обеспечить весьма подробную информацию в реальном времени о росте биопленки плесневые под потока.
Introduction
Кандидоз (C. albicans) это оппортунистическая грибкового патогена людей, которые могут заразить многих типов тканей, включая устные слизистой поверхности, вызывая Ротоглоточный кандидоз и приводит к нижней качества жизни для пострадавших лиц1. Биопленки является важной характеристикой для патогенеза C. albicans, и многочисленные исследования проводились на формирование и функции C. albicans биопленки,2,3,,4, 5, многие из которых были проведены с использованием статических (отсутствие потока) в vitro модели. Однако C. albicans необходимо придерживаться и расти в присутствии слюны в ротовой полости. Были разработаны многочисленные потока системы для клеток изображений6,,78,9,10. Эти различные системы были разработаны для различных целей, и поэтому каждая система имеет свои сильные и слабые стороны. Мы обнаружили, что многие из потока, который систем подходит для C. albicans были дорогостоящими, требуется комплекс готовых частей, или не удалось образы во время потока и пришлось прекратить до изображений. Поэтому мы разработали Роман потока аппарат для изучения C. albicans биопленки под поток11. При разработке нашего потока аппарата мы следовали этих основных соображений. Во-первых, мы хотели иметь возможность определить несколько аспектов биопленки роста и развития в режиме реального времени без необходимости использования флуоресцентных клеток (позволяет нам легко исследование мутантных штаммов и неизмененной клинических изолятов). Во-вторых, мы хотели, чтобы все части будут коммерчески доступны с практически никаких изменений (т.е., не изготовление на заказ), позволяя другим пользователям более легко воссоздать нашей системы и позволяет легко ремонт. В-третьих, мы также хотели бы позволить для расширенных изображений раз на достаточно высокий дебит. И наконец мы хотели, после периода клеток, придавая субстрат под поток, чтобы иметь возможность контролировать рост биопленки в течение продолжительного времени без введения новых клеток.
Эти соображения привели нас к разработке двух колбу рециркуляционный потока системы показан на рисунке 1. Две фляги позволяют нам разделить эксперимент в два этапа, вложение фазы, который черпает из клеток семенами вложение колбу и фазы роста, который использует ячейки свободных средств массовой информации для продолжения роста биопленки без добавления новых клеток. Эта система предназначена для работы с камерой инкубации для микроскопа, с слайд и труб, предшествующих его (2-5, рис. 1) размещены внутри инкубатора, и все другие компоненты помещены в большой вторичный контейнер снаружи Микроскоп. Кроме того плитой мешалкой с прилагаемой Термощуп используется для поддержания грибковых клеток в колбу вложение в 37 ° C. Как это рециркуляции, эта система способна непрерывной съемки во время потока (может быть более чем 36 часов, в зависимости от условий) и может быть использован на большинстве стандартных Микроскопы, включая прямыми или инвертированными benchtop микроскопы. Здесь мы обсуждаем Ассамблея, операции, и очистки потока аппарата, а также как обеспечить некоторые основные ImageJ количественных алгоритмы анализа видео после эксперимента.
Protocol
Representative Results
Discussion
Использование системы потока изложенные выше позволяет поколения количественных покадровой видео биопленки грибковые роста и развития. Для проведения сравнений между эксперименты это исключительно важное значение для обеспечения визуализации параметры то же самое. Это включает в с…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать доктор Wade Sigurdson для предоставления ценный вклад в дизайн аппарата потока.
Materials
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge – Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 micron in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 micron inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
- Pankhurst, C. L. Candidiasis (oropharyngeal). BMJ clinical evidence. 2012, 1304 (2012).
- Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Revista iberoamericana de micología. 18 (4), 163-170 (2001).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current biology: CB. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Blankenship, J. R., Mitchell, A. P. How to build a biofilm: a fungal perspective. Current opinion in microbiology. 9 (6), 588-594 (2006).
- Araújo, D., Henriques, M., Silva, S. Portrait of Candida Species Biofilm Regulatory Network Genes. Trends in microbiology. 25 (1), 62-75 (2017).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments. (59), e3349 (2012).
- Bakker, D. P., van der Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., van der Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Applied and environmental microbiology. 69 (10), 6280-6287 (2003).
- Zhang, W., Sileika, T. S., Chen, C., Liu, Y., Lee, J., Packman, A. I. A novel planar flow cell for studies of biofilm heterogeneity and flow-biofilm interactions. Biotechnology and bioengineering. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J. L. An easy and economical in vitro method for the formation of Candida albicans biofilms under continuous conditions of flow. Virulence. 1 (6), 483-487 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- McCall, A., Edgerton, M. Real-Time Approach to Flow Cell Imaging of Candida albicans Biofilm Development. Journal of fungi. 3 (1), 13 (2017).
- Zhang, B., Zerubia, J., Olivo-Marin, J. -. C. Gaussian approximations of fluorescence microscope point-spread function models. Applied optics. 46 (10), 1819-1829 (2007).
- Tati, S., et al. Candida glabrata Binding to Candida albicans Hyphae Enables Its Development in Oropharyngeal Candidiasis. PLoS pathogens. 12 (3), 1005522 (2016).
