マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中の神経回路の光遺伝学的操作
Summary
ここでは、マウスにおける睡眠/覚醒状態のモニタリング中に特定のタイプのニューロンを光遺伝学的に操作する方法を説明し、ストリア末端のベッド核に関する最近の研究を例に挙げる。
Abstract
近年、光遺伝学は神経科学研究の多くの分野で広く使用されている。多くの場合、チャネルロドプシン2(ChR2)のようなオプシンは、様々なCreドライバマウスにおける特定のタイプの神経細胞におけるウイルスベクターによって発現される。これらのオプシンの活性化は、光学ケーブルを介してレーザーまたはLEDによって送達される光パルスの適用によって引き起こされ、活性化の効果は非常に高い時間分解能で観察される。実験者は、マウスの行動や他の生理学的結果を監視しながら、ニューロンを急性刺激することができる。光遺伝学は、マウスの睡眠/覚醒状態の調節における神経回路の機能を評価するのに有用な戦略を可能にすることができる。ここでは、マウスの睡眠段階を評価するために、脳波計(EEG)および筋電図(EMG)モニタリング中に特定の化学的同一性を有するニューロンの光遺伝学的操作の効果を調べる技術について説明する。一例として、ストリア末端子(BNST)のベッド核におけるGABAergicニューロンの操作について説明する。これらのニューロンの急性光遺伝学的興奮は、NREM睡眠中に適用されたときに覚醒への急速な移行をトリガーします。EEG/EMG記録と共に光遺伝学的操作は、睡眠/覚醒状態を調節する神経回路を解読するために適用することができます。
Introduction
睡眠は最適な認知機能に不可欠です。最近の知見はまた、睡眠障害が1、2、3の広範な疾患に関連していることを示唆している。睡眠の機能はまだほとんど未解決ですが、睡眠/覚醒状態4を制御する神経回路とメカニズムを理解する上で、最近大きな進歩が見られます。哺乳類には、覚醒、非急速眼球運動(NREM)睡眠、急速眼球運動(レム)睡眠の3つの警戒状態があります。覚醒度は、目的と持続的な運動活動を有する低振幅の高速EEG振動(5-12 Hz)によって特徴付けられます。NREM睡眠は、意識と意図的な運動活動の欠如と高振幅(デルタ波)の遅い振動(1-4 Hz)によって定義されます。レム睡眠は、低振幅の比較的速い振動(6-12 Hz)とほぼ完全な両側筋アトニア5によって特徴付けられます。
Borbelyは、2つのプロセスモデル6、7として知られている睡眠覚醒調節の理論を提案した。恒静止プロセスは、プロセスSとも呼ばれ、覚醒中に蓄積し、睡眠中に消散する睡眠圧を表します。プロセス C と呼ばれる別のプロセスは概日プロセスであり、24 時間サイクルで警戒レベルが変動する理由を説明します。これら2つのプロセスに加えて、同種化因子は睡眠/覚醒8、9の調節にとっても重要である。同一性因子には栄養状態と感情が含まれる。恐怖と不安は、通常、自律神経および神経内分泌応答10、11、12と共に覚醒の増加を伴う。四肢系は恐怖と不安の調節に役割を果たすと考えられており、自律神経および神経内分泌応答の基礎となるメカニズムは広範囲に研究されているが、四肢系が睡眠/覚醒状態に影響を与える経路は、そうでない。まだ明らかにされていない。光と薬理遺伝学を用いた最近の研究の多くは、睡眠/覚醒状態を調節するニューロンおよびニューロン回路が、皮質、基底前脳、視床下部、視床下部を含む脳全体に分布していることを示唆している。そして脳幹。特に、光遺伝学の最近の進歩により、高い空間的および時間的分解能を持つ特定の神経回路in vivoを刺激または阻害することができました。この技術は、睡眠と覚醒の神経基板の理解の進歩を可能にし、睡眠/覚醒状態は概日プロセス、睡眠圧、感情を含む同種の要因によってどのように調節されるかを理解する。本論文は、NREM睡眠、レム睡眠の調節に役割を果たす脳内のコネクトームやメカニズムに対する理解を新しくする可能性のある、睡眠/覚醒記録と組み合わせた光遺伝学的操作の使用方法を紹介することを目的としています。そして覚醒。不眠症は通常、睡眠不足の不安や睡眠を取ることができない恐れ(ソムフォビア)に関連しているので、四肢系が睡眠/覚醒状態を調節するこのメカニズムの理解は、健康にとって最も重要です。
BNSTは、不安と恐怖に不可欠な役割を果たすと考えられています。GAD 67-発現GABAergicニューロンは、BNST12,13の主要集団である。これらのニューロン(GABABNST)が睡眠/覚醒状態に及ぼす影響を調べた。近年の神経科学の最大の進歩の一つは、高い空間的および時間的分解能を持つ生体内で特定の化学的アイデンティティを持つニューロンの操作を可能にする方法である。光遺伝学は、神経活動と特定の行動応答14との因果関係を実証するために非常に有用である。睡眠/覚醒状態の調節における定義された神経回路の機能的接続性を調べる方法として光遺伝学を説明する。この技術を利用することで、睡眠/覚醒状態を調節する神経回路の理解に大きな進歩が見られた15,16,17,18,19.多くの場合、オプシンは、Cre-driverマウスとクレ誘導性AAV媒介遺伝子伝達遺伝子の組み合わせによって選択的脳領域の特定の化学的アイデンティティを有するニューロンに特異的に導入される。さらに、チャネロドプシン2(ChR2)20またはアルカエルホドプシン(ArchT)21などの光感受性オプシンの焦点発現は、Cre-loxPまたはFlp-FRT系と組み合わせることで、選択的ニューロン集団および特異的な運動を操作することを可能にする。神経経路22.
BNSTにおけるGABAergicニューロンに関する実験を例として説明する.指定されたニューロン集団でオプシンを発現させるには、適切なCreドライバマウスおよびCre依存性ウイルスベクターが最も頻繁に使用される。オプシンが特に神経集団で発現されるトランスジェニックまたはノックインラインも有用である。以下の実験では、GABAergicニューロンのみがC57BL/6J遺伝的背景を有するクレレコンビナーゼを発現するGAD67-Creノックインマウス23と、EFPまたはEYFPと融合したChR2(hChR2 H134R)を含むAAVベクターを対照として用いた。「FLEx(フリップ切除)スイッチ」24を使用します。手順は、具体的に睡眠/覚醒状態25のモニタリング中にBNSTにおけるGABAergicニューロンの光遺伝学的興奮を説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、睡眠/覚醒の状態遷移に対する特定の化学的アイデンティティを有するニューロンの光遺伝学的刺激の効果を評価する方法を提示し、GABABNSTニューロンの操作の例を示した。我々のデータは、GABABNSTニューロンの光遺伝学的興奮は、NREM睡眠から覚醒への即時移行をもたらすことを示した。
数多くのタイプの光遺伝学的ツールの開発により、様々?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、メルク研究者研究プログラム(#54843)、革新的分野に関する科学的研究のためのKAKENHI助成金、ウィルダイナミクス(16H06401)(T.S.)、および革新的分野に関する探索的研究のためのKAKENHI助成金(T.S.)によって支援されました。(18H02595)。
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
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