Summary

Оптогенетическое манипулирование нейронными цепями во время мониторинга сна / бодрствования государств у мышей

Published: June 19, 2019
doi:

Summary

Здесь мы описываем методы оптогенетической манипуляции определенными типами нейронов во время мониторинга состояния сна/бодрствования у мышей, представляя нашу недавнюю работу над ядром кровати stria terminalis в качестве примера.

Abstract

В последние годы оптогенетика широко используется во многих областях нейронаучных исследований. Во многих случаях опсин, например канал родопсин 2 (ChR2), выражается вирусным вектором в определенном типе нейрональных клеток у различных мышей-кре-драйверов. Активация этих опсинов вызвана применением световых импульсов, которые поставляются лазером или светодиодом через оптические кабели, и эффект активации наблюдается с очень высоким разрешением времени. Экспериментаторы способны остро стимулировать нейроны при мониторинге поведения или другого физиологического исхода у мышей. Оптогенетика может позволить полезные стратегии для оценки функции нейрональных цепей в регуляции сна / бодрствования состояний у мышей. Здесь мы описываем методику изучения влияния оптогенетических манипуляций нейронов с определенной химической идентичностью во время электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и мониторинга электромиограммы (ЭМГ) для оценки стадии сна мышей. В качестве примера мы описываем манипуляции ГАМК нейронов в ядре кровати stria terminalis (BNST). Острое оптогенетическое возбуждение этих нейронов вызывает быстрый переход к бодрствованию при применении во время сна NREM. Оптогенетические манипуляции наряду с записью ЭЭГ/ЭМГ могут быть применены для расшифровки нейрональных цепей, которые регулируют состояния сна/бодрствования.

Introduction

Сон необходим для оптимальной когнитивной функции. Последние результаты также свидетельствуют о том, чтонарушения во сне связаны с широким спектром заболеваний 1,2,3. Хотя функции сна до сих пор в значительной степени нерешенными, значительный прогресс был достигнут в последнее время в понимании нейронных цепей и механизмов, которые контролируют сон / бодрствования государства4. У млекопитающих существует три состояния бдительности: бодрствование, небыстрое движение глаз (NREM) сна, и быстрое движение глаз (REM) сна. Пробуждение характеризуется быстрыми колебаниями ЭЭГ (5-12 Гц) низкой амплитуды с целенаправленной и устойчивой двигательной активностью. Сон NREM определяется медленными колебаниями (1-4 Гц) высокой амплитуды (дельтовые волны), с отсутствием сознания и целенаправленной двигательной активностью. REM сон характеризуется относительно быстрыми колебаниями (6-12 Гц) низкой амплитудыи почти полной двусторонней атонии мышц 5.

Борбели предложил теорию регулирования сна бодрствования, известной как две модели процесса6,7. Гомеостатический процесс, также называемый процессом S, представляет давление сна, которое накапливается во время бодрствования и рассеивается во время сна. Другой процесс, называемый процессом C, является циркадным процессом, который объясняет, почему уровни бдительности колеблются в 24 h цикле. В дополнение к этим двум процессам, аллостатические факторы также важны для регулирования сна / бодрствования8,9. Аллостатические факторы включают состояние питания и эмоции. Страх и тревога, как правило, сопровождается увеличением возбуждения наряду с вегетативными и нейроэндокринными ответами10,11,12. Лимбическая система, как полагают, играют определенную роль в регуляции страха и тревоги, и механизмы, лежащие в основе вегетативных и нейроэндокринных реакций были изучены широко, но путь, по которому лимбическая система влияет на сон / бодрствование государства не но были выявлены. Большое количество недавних исследований с использованием опто- и фармакогенетики показали, что нейроны и нейронные цепи, которые регулируют сон / бодрствования государства распространяются по всему мозгу, в том числе кортики, базальный предмозг, таламус, гипоталамус, и ствол мозга. В частности, последние достижения в области оптогенетики позволили нам стимулировать или ингибировать специфические нейронные цепи in vivo с высокимпространственным и временным разрешением. Этот метод позволит прогрессировать в нашем понимании нервных субстратов сна и бодрствования, и как сон / бодрствование государства регулируются циркадных процессов, давление сна, и аллостатические факторы, в том числе эмоции. Эта статья направлена на введение, как использовать оптогенетические манипуляции в сочетании с записью сна / бодрствования, которые могли бы иметь потенциал для обновления нашего понимания коннектомы и механизмы в головном мозге, которые играют роль в регулировании сна NREM, REM сна, и бодрствования. Понимание этого механизма, с помощью которого лимбическая система регулирует состояние сна/бодрствования имеет первостепенное значение для здоровья, потому что бессонница обычно ассоциируется с тревогой или страхом быть не в состоянии спать (сомнифобия).

Считается, что BNST играет важную роль в тревоге и страхе. GAD67-выражение ГАМК нейронов являются основной популяции BNST12,13. Мы изучили влияние оптогенетических манипуляций этих нейронов (GABABNST) на сон / бодрствования государств. Одним из величайших достижений в области неврологии в последние годы были методы, которые позволяют манипулировать нейронами с определенными химическими идентичностями in vivo, с высоким пространственным и временным разрешением. Оптогенетика очень полезна для демонстрации причинно-следственной связи между нервной активностью и специфическими поведенческими реакциями14. Мы описываем оптогенетику как метод изучения функциональной связи определенных нейронных цепей в регуляции состояний сна/бодрствования. Используя эту технику, большой прогресс был достигнут в понимании нейрональных цепей, которые регулируют сон / бодрствования государства15,16,17,18,19 . Во многих случаях, opsins специфически введены в невенарах с определенными химическими тождественноплетениями в селективных зонах мозга комбинацией мышей Cre-водителя и Cre-индуцируемого AAV-опосредованного перехода гена. Кроме того, фокусное выражение фоточувствительных опсинов, таких как каналродопсин 2 (ChR2)20 или архаэродопсин (ArchT)21 в сочетании с Cre-loxP или Flp-FRT система позволяет манипулировать селективной нейронной популяции и конкретных нейронный путь22.

Мы описываем здесь эксперименты на ГАМК нейронов в BNST в качестве примера. Для выражения опсинов в назначенной нейрональной популяции наиболее часто используются соответствующие мыши-водители Cre и cre-dependent virus vectors. Трансгенные или стук-в линии, в которых опсины выражаются, в частности, нейронных популяций также полезны. В следующих экспериментах, мы использовали GAD67-Cre стук-в мышах23, в котором только ГАМК-нейроны выразить Cre рекомбиназы с C57BL/6J генетического фона, и вектор AAV, который содержит ChR2 (hChR2 H134R) сливается с EYFP или EYFP в качестве контроля с переключателем “FLEx (Flip-excision)24. Процедура конкретно описывает оптогенетическое возбуждение ГАМК нейронов в BNST во время мониторинга сна / бодрствования государства25.

Protocol

Все эксперименты здесь были одобрены Комитетом по эксперименту и использованию животных Университета Цукуба, в соответствии с руководящими принципами NIH. 1. Хирургия животных, инъекция вируса, электрод для ЭЭГ/ЭМГ и имплантация оптического волокна <strong…

Representative Results

Настоящее исследование показало влияние оптогенетического возбуждения нейронов ГАМКBNST на переходное состояние сна. ChR2-EYFP был focally выражается в ГАМК нейронов в BNST. На месте гибридизации гистохимических исследование показало, что ChR2-EYFP был colocalized в нейронах, выра?…

Discussion

Здесь мы представили метод для оценки влияния оптогенетической стимуляции нейронов с особыми химическими идентичностями на состояние переходов сна / бодрствования и дал пример манипуляции ГАМКBNST нейронов. Наши данные показали, что оптогенетическое возбуждение нейронов ГАМК

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Мерк Следователь исследований программы (#54843), KAKENHI Грант-в-помощь для научных исследований по инновационным областям, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.), и KAKENHI Грант-в-помощь для исследовательских исследований по инновационным областям (T.S.) (18H02595).

Materials

1×1 Fiber-optic Rotary Joints Doric FRJ 1×1 FC-FC for optogenetics
6-pin header KEL corporation DSP02-006-431G
6-pin socket Hirose 21602X3GSE
A/D converter Nippon koden N/A Analog to digital converter
AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP 3.70×1013(genomic copies/ml)
AAV10-EF1a-DIO-EYFP 5.82×1013(genomic copies/ml)
Ampicillin Fuji film 014-23302
Amplifier Nippon koden N/A for EEG/EMG recording
Anesthetic vaporizer Muromachi MK-AT-210D
Automatic injecter KD scientific 780311
Carbide cutter Minitor B1055 φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor 
Cyanoacrylate adhesion  (Aron alpha A) and acceleration Konishi #30533
Dental curing light 3M Elipar S10
Epoxy adhesive Konishi #04888 insulation around the solder of 6-pin and shielded cable
Fiber optic patch cord (branching) Doric BFP(#)_50/125/900-0.22
Gad67-Cre mice provided by Dr. Kenji Sakimura Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele
Hamilton syringe Hamilton 65461-01
High speed rotary micromotor kit FOREDOM K.1070 Used with carbide cutter
Interconnecting sleeve Thorlab ADAF1 φ2.5 mm Ceramic 
Isoflurane Pfizer 871119
Laser   Rapp OptoElectronic N/A 473nm wave length
Laser intesity checker COHERENT 1098293
Laser stimulator Bio research center STO2 reffered as pulse generator in text
Optic fiber with ferrule  Thorlab FP200URT-CANNULA-SP-JP
pAAV2-rh10 provided by PennVector Core
pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA Addgene plasimid # 20296
pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA provided by Dr. Karl Deisseroth
Patch cord Doric D202-9089-0.4 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint
pHelper Stratagene
Photocurable dental cement 3M 56846
Serafin clamp Stoelting 52120-43P
Shielded cable mogami W2780 Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording
Sleep recording chamber N/A N/A Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder
Sleep sign software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG analysis
Slip ring neuroscience,inc N/A for EEG/EMG analysis
Stainless screw Yamazaki N/A φ1.0 x 2.0
Stainless wire Cooner wire AS633  0.0130 inch diameter
Stereotaxic frame with digital console Koph N/A Model 940
Syringe needle Hamilton 7803-05
Vital recorder software KISSEI COMTEC N/A for EEG/EMG recording

References

  1. Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
  2. Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
  3. Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
  4. Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
  5. Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
  6. Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
  7. Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
  8. Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
  9. Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
  10. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
  11. Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
  12. Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
  13. Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
  14. Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
  15. de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
  16. Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
  17. Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
  18. Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
  19. Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
  20. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  21. Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
  22. Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
  23. Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
  24. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
  25. Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
  26. Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
  27. Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
  28. Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).

Play Video

Cite This Article
Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice. J. Vis. Exp. (148), e58613, doi:10.3791/58613 (2019).

View Video