Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen
Summary
Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.
Abstract
In de afgelopen jaren, optogenetics is op grote schaal gebruikt in vele gebieden van neurowetenschappelijk onderzoek. In veel gevallen, een opsin, zoals kanaal rhodopsine 2 (ChR2), wordt uitgedrukt door een virus vector in een bepaald type van neuronale cellen in verschillende CRE-driver muizen. Activering van deze opsins wordt veroorzaakt door de toepassing van lichtflitsen die worden geleverd door laser of geleid door optische kabels, en het effect van activering wordt waargenomen met zeer hoge tijdresolutie. Experimenteurs zijn in staat om acuut neuronen te stimuleren tijdens het monitoren van gedrag of een andere fysiologische uitkomst bij muizen. Optogenetics kan nuttige strategieën om te evalueren van de functie van neuronale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen mogelijk te maken. Hier beschrijven we een techniek voor het onderzoeken van het effect van optogenetische manipulatie van neuronen met een specifieke chemische identiteit tijdens elektro-encefalogram (EEG) en electromyogram (EMG) monitoring om de slaap fase van muizen te evalueren. Als voorbeeld beschrijven we manipulatie van GABAergic neuronen in de bed kern van de Stria terminalis (BNST). Acute optogenetische excitatie van deze neuronen activeert een snelle overgang naar wakkerheid wanneer toegepast tijdens de NREM-slaap. Optogenetische manipulatie samen met EEG/EMG opname kan worden toegepast om te ontcijferen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren.
Introduction
Slaap is essentieel voor een optimale cognitieve functie. Recente bevindingen suggereren ook dat verstoringen in de slaap worden geassocieerd met een breed scala aan ziekten1,2,3. Hoewel de functies van de slaap zijn nog grotendeels onopgeloste, substantiële vooruitgang is onlangs gemaakt in het begrijpen van de neurale circuits en mechanismen die controle slaap/wakkerheid Staten4. In zoogdieren, er zijn drie staten van waakzaamheid: wakkerheid, non-Rapid Eye Movement (NREM) slaap, en Rapid Eye Movement (REM) slaap. Wakkerheid wordt gekenmerkt door snelle EEG-oscillaties (5-12 Hz) van lage amplitude met doelbewuste en aanhoudende motorische activiteit. NREM-slaap wordt gedefinieerd door langzame oscillaties (1-4 Hz) van hoge amplitude (delta golven), met gebrek aan bewustzijn en doelbewuste motorische activiteit. REM-slaap wordt gekenmerkt door relatief snelle oscillaties (6-12 Hz) van lage amplitude en bijna volledige bilaterale spier atonia5.
Borbely stelde een theorie van slaap-wakkerheid verordening voor, bekend als de twee procesmodel6,7. Een homeostatisch proces, ook wel proces S genoemd, vertegenwoordigt slaap druk die zich ophoteert tijdens wakkerheid en verdwijnt tijdens de slaap. Een ander proces, aangeduid als proces C, is een circadiane proces, die verklaart waarom waakzaamheid niveaus fluctueren in de 24 h cyclus. Naast deze twee processen, allostatische factoren zijn ook belangrijk voor de regulering van de slaap/wakkerheid8,9. Allostatische factoren omvatten voedings toestanden en emotie. Angst en angst gaan meestal gepaard met een toename van de opwinding samen met autonome en neuro-endocriene reacties10,11,12. Het limbisch systeem wordt verondersteld om een rol te spelen in de regulering van angst en angst, en mechanismen die onderliggende autonome en neuro-endocriene reacties zijn uitgebreid bestudeerd, maar het pad waardoor het limbisch systeem beïnvloedt slaap/wakkerheid Staten heeft niet nog niet is onthuld. Een groot aantal recente studies met behulp van opto-en farmacogenetica hebben gesuggereerd dat neuronen en neuronale circuits die reguleren van slaap/wakkerheid Staten zijn verdeeld over de hersenen, met inbegrip van de cortices, basale forebrain, thalamus, hypothalamus, en hersenstam. In het bijzonder, recente ontwikkelingen in optogenetics hebben ons toegestaan om te stimuleren of te remmen specifieke neurale circuits in vivo met hoge ruimtelijke en tijdelijke resoluties. Deze techniek zal leiden tot vooruitgang in ons begrip van de neurale substraten van slaap en wakkerheid, en hoe slaap/wakkerheid Staten worden gereguleerd door circadiane processen, slaap druk, en allostatische factoren, met inbegrip van emotie. Dit artikel is bedoeld om te introduceren hoe optogenetische manipulatie gecombineerd met slaap/waak opname, die het potentieel hebben om ons begrip van de connectomes en mechanismen in de hersenen die een rol spelen in de regulering van NREM slaap, REM slaap, en wakkerheid. Begrip van dit mechanisme waardoor het limbisch systeem slaap/wakkerheid regelt is van het allergrootste belang voor de gezondheid, omdat slapeloosheid meestal wordt geassocieerd met angst of angst om niet in staat om te slapen (somniphobia).
De BNST wordt verondersteld een essentiële rol te spelen in angst en vrees. Gad 67-het uitdrukken van GABAergic neuronen zijn een grote populatie van de bnst12,13. We onderzochten het effect van optogenetische manipulatie van deze neuronen (GABABnst) op slaap/wakkerheid Staten. Een van de grootste vooruitgang in de neurowetenschappen in de afgelopen jaren is methoden die manipulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten in vivo mogelijk maken, met hoge ruimtelijke en temporele resoluties. Optogenetics is zeer nuttig voor het aantonen van causale verbanden tussen neurale activiteit en specifieke gedrags responsen14. We beschrijven optogenetics als een methode voor het onderzoeken van de functionele connectiviteit van gedefinieerde neurale circuits in de regulering van de slaap/wakkerheid Staten. Door gebruik te maken van deze techniek, grote vooruitgang is bereikt in het begrijpen van de neuronale circuits die slaap/wakkerheid staten reguleren15,16,17,18,19 . In veel gevallen worden opsins specifiek geïntroduceerd in neuronen met specifieke chemische identiteiten in selectieve hersengebieden door een combinatie van CRE-driver muizen en CRE-inducible AAV-gemedieerde genoverdracht. Verder, focale uitdrukking van foto-gevoelige opsins zoals channelrhodopsin 2 (ChR2)20 of archaerhodopsin (archt)21 in combinatie met een CRE-Loxp of FLP-FRT-systeem stelt ons in staat om een selectieve neuronale populatie te manipuleren en specifieke Neural pathway22.
We beschrijven hier experimenten op GABAergic neuronen in de BNST als voorbeeld. Om opzonden in een aangewezen neuronale populatie uit te drukken, worden geschikte CRE driver muizen en CRE-afhankelijke virus vectoren het vaakst gebruikt. Transgene of knock-in lijnen waarin opsins worden uitgedrukt in het bijzonder neuronale populaties zijn ook nuttig. In de volgende experimenten gebruikten we GAD67-CRE knock-in muizen23 waarin alleen GABAergic neuronen Express CRE of met een C57BL/6j genetische achtergrond, en een Aav vector die CHR2 bevat (hChR2 H134R) gesmolten met eyfp of eyfp als een controle met een “FLEx (Flip-excision) schakelaar”24. De procedure specifiek beschrijft optogenetische excitatie van GABAergic neuronen in de BNST tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid Staten25.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hier presenteerde een methode voor het evalueren van het effect van optogenetische stimulatie van neuronen met bepaalde chemische identiteiten op staat overgangen van slaap/wakkerheid en gaf een voorbeeld van manipulatie van GABABnst neuronen. Onze gegevens toonden aan dat optogenetische excitatie van GABABnst neuronen resulteert in onmiddellijke overgang van NREM slaap naar wakkerheid.
Verschillende experimentele ontwerpen zijn beschikbaar vanwege de ontwikkeling van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het Merck Investigator studies-programma (#54843), een KAKENHI-subsidie voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden, “WillDynamics” (16H06401) (T.S.), en een KAKENHI-subsidie voor verkennend onderzoek naar innovatieve gebieden (T.S.) (18H02595).
Materials
| 1×1 Fiber-optic Rotary Joints | Doric | FRJ 1×1 FC-FC | for optogenetics |
| 6-pin header | KEL corporation | DSP02-006-431G | |
| 6-pin socket | Hirose | 21602X3GSE | |
| A/D converter | Nippon koden | N/A | Analog to digital converter |
| AAV10-EF1a-DIO-ChR2-EYFP | 3.70×1013(genomic copies/ml) | ||
| AAV10-EF1a-DIO-EYFP | 5.82×1013(genomic copies/ml) | ||
| Ampicillin | Fuji film | 014-23302 | |
| Amplifier | Nippon koden | N/A | for EEG/EMG recording |
| Anesthetic vaporizer | Muromachi | MK-AT-210D | |
| Automatic injecter | KD scientific | 780311 | |
| Carbide cutter | Minitor | B1055 | φ0.7 mm. Reffered as dental drill, used with high speed rotary micromotor |
| Cyanoacrylate adhesion (Aron alpha A) and acceleration | Konishi | #30533 | |
| Dental curing light | 3M | Elipar S10 | |
| Epoxy adhesive | Konishi | #04888 | insulation around the solder of 6-pin and shielded cable |
| Fiber optic patch cord (branching) | Doric | BFP(#)_50/125/900-0.22 | |
| Gad67-Cre mice | provided by Dr. Kenji Sakimura | Cre recombinase gene is knocked-in in the Gad67 allele | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 65461-01 | |
| High speed rotary micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Used with carbide cutter |
| Interconnecting sleeve | Thorlab | ADAF1 | φ2.5 mm Ceramic |
| Isoflurane | Pfizer | 871119 | |
| Laser | Rapp OptoElectronic | N/A | 473nm wave length |
| Laser intesity checker | COHERENT | 1098293 | |
| Laser stimulator | Bio research center | STO2 | reffered as pulse generator in text |
| Optic fiber with ferrule | Thorlab | FP200URT-CANNULA-SP-JP | |
| pAAV2-rh10 | provided by PennVector Core | ||
| pAAV-EF1a-DIO-EYFP-WPRE-HGHpA | Addgene | plasimid # 20296 | |
| pAAV-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA | provided by Dr. Karl Deisseroth | ||
| Patch cord | Doric | D202-9089-0.4 | 0.4m length, laser conductor between laser and rotary joint |
| pHelper | Stratagene | ||
| Photocurable dental cement | 3M | 56846 | |
| Serafin clamp | Stoelting | 52120-43P | |
| Shielded cable | mogami | W2780 | Soldering to 6-pin socket for EEG/EMG recording |
| Sleep recording chamber | N/A | N/A | Custum-made (21cm× 29cm × 19cm) with water tank holder |
| Sleep sign software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Slip ring | neuroscience,inc | N/A | for EEG/EMG analysis |
| Stainless screw | Yamazaki | N/A | φ1.0 x 2.0 |
| Stainless wire | Cooner wire | AS633 | 0.0130 inch diameter |
| Stereotaxic frame with digital console | Koph | N/A | Model 940 |
| Syringe needle | Hamilton | 7803-05 | |
| Vital recorder software | KISSEI COMTEC | N/A | for EEG/EMG recording |
References
- Spoormaker, V. I., Montgomery, P. Disturbed sleep in post-traumatic stress disorder: Secondary symptom or core feature?. Sleep Medicine Reviews. 12 (3), 169-184 (2008).
- Dworak, M., Wiater, A., Alfer, D., Stephan, E., Hollmann, W., Struder, H. K. Increased slow wave sleep and reduced stage 2 sleep in children depending on exercise intensity. Sleep Medicine. 9 (3), 266-272 (2008).
- Mellman, T. A. Sleep and anxiety disorders. Psychiatric Clinics of North America. 29 (4), 1047-1058 (2006).
- Scammell, T. E., Arrigoni, E., Lipton, J. O. Neural circuitry of wakefulness and sleep. Neuron. 93 (4), 747-765 (2017).
- Chemelli, R. M., et al. Narcolepsy in orexin knockout mice: Molecular genetics of sleep regulation. Cell. 98 (4), 437-451 (1999).
- Borbély, A. A., Daan, S., Wirz-Justice, A., Deboer, T. The two-process model of sleep regulation: A reappraisal. Journal of Sleep Research. 25 (2), 131-143 (2016).
- Daan, S., Beersma, D. G., Borbely, A. A. Timing of human sleep: recovery process gated by a circadian pacemaker. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 246 (2), R161-R183 (1984).
- Saper, C. B., Cano, G., Scammell, T. E. Homeostatic, circadian, and emotional regulation of sleep. Journal of Comparative Neurology. 493 (1), 92-98 (2005).
- Saper, C. B., Fuller, P. M., Pedersen, N. P., Lu, J., Scammell, T. E. Sleep state switching. Neuron. 68 (6), 1023-1042 (2010).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Tovote, P., Fadok, J. P., Lüthi, A. Neuronal circuits for fear and anxiety. Nature Reviews Neuroscience. 16 (6), 317-331 (2015).
- Lebow, M. A., Chen, A. Overshadowed by the amygdala: the bed nucleus of the stria terminalis emerges as key to psychiatric disorders. Molecular Psychiatry. 21 (4), 450-463 (2016).
- Wu, S., et al. Tangential migration and proliferation of intermediate progenitors of GABAergic neurons in the mouse telencephalon. Development. 138 (12), 2499-2509 (2011).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nature Reviews Neuroscience. 13 (4), 251-266 (2012).
- de Lecea, L., Carter, M. E., Adamantidis, A. Shining light on wakefulness and arousal. Biological Psychiatry. 71 (12), 1046-1052 (2012).
- Carter, M. E., Brill, J., Bonnavion, P., Huguenard, J. R., Huerta, R., de Lecea, L. Mechanism for hypocretin-mediated sleep-to-wake transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2635-E2644 (2012).
- Weber, F., Dan, Y. Circuit-based interrogation of sleep control. Nature Publishing Group. 538, 51-59 (2016).
- Weber, F., Chung, S., Beier, K. T., Xu, M., Luo, L., Dan, Y. Control of REM sleep by ventral medulla GABAergic neurons. Nature. 526, 435-438 (2015).
- Oishi, Y., et al. Slow-wave sleep is controlled by a subset of nucleus accumbens core neurons in mice. Nature Communications. 8 (1), 1-12 (2017).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., et al. A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 1-8 (2011).
- Kim, C. K., Adhikari, A., Deisseroth, K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 18 (4), 222-235 (2017).
- Saito, Y. C., et al. GABAergic neurons in the preoptic area send direct inhibitory projections to orexin neurons. Frontiers in Neural Circuits. 7 (December), 1-3 (2013).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping. Journal of Neuroscience. 28 (28), 7025-7030 (2008).
- Kodani, S., Soya, S., Sakurai, T. Excitation of GABAergic neurons in the bed nucleus of the stria terminalis triggers immediate transition from non-rapid eye movement sleep to wakefulness in mice. Journal of Neuroscience. 37, 7174-7176 (2017).
- Lin, F., Pichard, J. . Handbook of practical immunohistochemistry: frequently asked questions. , (2011).
- Wiegert, J. S., Mahn, M., Prigge, M., Printz, Y., Yizhar, O. Silencing neurons: tools, applications, and experimental constraints. Neuron. 95 (3), 504-529 (2017).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Prigge, M., Schneider, F., Davidson, T. J., O’Shea, D. J., Sohal, V. S., Goshen, I., Finkelstein, J., Paz, J. T., Stehfest, K., Fudim, R., Ramakrishnan, C., Huguenard, J. R., Hegemann, P., Deisseroth, K. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction. Nature. 40 (6), 1301-1315 (2012).
