Stroom cytometrische detectie van nieuwgevormde stamcel-achtige borstkankercellen na Apoptosis omkering
Summary
Hier presenteren we een protocol om te isoleren van apoptotic borstkankercellen door fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en de overgang van niet-stam borstkankercellen aan stamcel-achtige borstkankercellen na apoptosis omkering verder kan worden opgespoord door stroom cytometry.
Abstract
Kanker terugkeerpatroon is lang bestudeerd door oncologists terwijl de onderliggende mechanismen zijn nog steeds onduidelijk. Onlangs, wij en anderen vond dat een verschijnsel genaamd apoptosis omkering tot verhoogde tumorigeniciteit in verschillende cel modellen onder verschillende prikkels leidt. Eerdere studies hebben gericht geweest op het bijhouden van dit proces in vitro en in vivo; het isolement van echte omgekeerde cellen moet echter nog worden bereikt, die onze kennis over de gevolgen van apoptosis omkering beperkt. Hier, profiteren we van een kleurstof Caspase-3/7 groen detectie op etiket cellen met geactiveerde caspases na apoptotic inductie. Cellen met positieve signalen zijn verder geregeld door fluorescentie-activated cell sorting (FACS) voor herstel. Morfologische onderzoek onder confocale microscopie bevestigt de apoptotic status vóór FACS. Een toename van de tumorigeniciteit kan vaak worden toegeschreven aan de stijging in het percentage van de cel van de stam van kanker (CSC)-als cellen. Ook, gezien de heterogeniteit van borstkanker, identificatie van de oorsprong van deze CSC-achtige cellen zou essentieel zijn voor de behandeling van kanker. Zo bereiden we niet-stam borstkankercellen voordat triggering apoptosis, caspase-geactiveerde cellen isoleren en uitvoeren van de procedure van de omkering apoptosis. Stroom cytometry analyse blijkt dat borst CSC-achtige cellen opnieuw in de omgekeerde groep verschijnen, die aangeeft borst CSC-achtige cellen zijn doortocht van niet-stam borstkankercellen tijdens apoptosis omkering. Kortom omvat dit protocol de isolatie van apoptotic borstkankercellen en detectie van veranderingen in CSC percentage in omgekeerde cellen door stroom cytometry.
Introduction
Kanker is een belangrijke doodsoorzaak, waardoor zware last aan landen wereldwijd1. Borstkanker rangen hoog zowel in termen van de incidentie en mortaliteit bij vrouwelijke patiënten onder alle soorten kanker1. Als gevolg van de heterogeniteit van de kanker, wordt een combinatie van drugs meestal gebruikt in chemotherapie om kanker cel dood2,3,4. Echter, aangezien gemeenschappelijke chemotherapeutische geneesmiddelen vaak richten op DNA5,6, eiwit synthese7,8 en/of microtubulus dynamiek,9, snelgroeiende cellen zijn het hardst getroffen terwijl zwakke cellen zoals kanker stamcel (CSC) s zijn meestal minder getroffen10. CSCs zijn, dus meer kans om te overleven na de behandeling, die later leidt tot resistentie tegen geneesmiddelen en kanker terugvalpreventie10,11. Vandaar, eliminatie van CSCs uitgegroeid tot een belangrijk onderwerp voor de behandeling van kanker en studie van de oorsprong van CSCs noodzakelijk is.
Meer studies over het fenomeen van apoptosis omkering zijn uitgevoerd in de afgelopen tien jaar12,13,14,15,16,17,18 , 19. vóór de opkomst van dit concept, het is algemeen aanvaard dat cellen apoptosis onherroepelijk zal ondergaan na activering van caspase. Caspases is een familie van eiwit-enzymen die spelen een sleutelrol in de inleiding en uitvoering stadia van apoptosis, met inbegrip van de vorming van de complexe apoptotic en de splitsing van downstream substraten20. Activering van de beul caspases zoals caspase-3 of caspase 7 heeft beschouwd als de “point of no return” voor apoptosis21. Onderzoekers onlangs merkte echter dat apoptosis terugboeking zowel in vitro plaatsvindt en in vivo, tijdens welke cellen van apoptosis zelfs na caspase activering12,13,14 herstellen kan , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Bovendien, agressieve eigenschappen zoals hogere weerstand tegen de oorspronkelijke apoptotic inductor en hogere invasiviteit worden gedetecteerd in de omgekeerde kanker cellen15. Derhalve werd voorgesteld dat het percentage van de CSC-achtige cellen hoger in de omgekeerde bevolking in vergelijking met de onbehandelde cellen, uiteindelijk bij te dragen tot de meer kwaadaardige functies na apoptosis omkering18zou zijn.
Eerder, vele inspanningen hebben gedaan om bij te houden van de apoptosis omkering in vitro en nog belangrijker, in vivo die enorm helpen bij de bevestiging van de universaliteit van dit proces16,17,19. Een systematische studie over de gevolgen van omgekeerde cellen ontbreekt echter als gevolg van de onbevredigende isolatie van cellen die werkelijk apoptosis omkering hebben ondergaan. Er is behoefte aan zuivere apoptotic cellen verwerven en herstellen hen voor verdere studie. Dus, we gebruiken de traditioneel goed aanvaarde markering van de beul caspase activering als de markering van de “point of no return”21 voor apoptosis en gebruik maken van de fluorescentie-activated cell sorting (FACS) om te discrimineren caspase-geactiveerde cellen gekleurd met Caspase-3/7 groen detectie kleurstof. De kleurstof is covalent gekoppeld aan een reeks van korte aminozuur, DEVD, die kan worden herkend en door actieve caspases 3/7 gekloofd. Het splijten helpt vrijlating van de kleurstof, die zal translocate van het cytosol aan de kern waar het zich bindt aan het DNA en stoot sterke fluorescentie. Deze procedure vermijdt met behulp van een bulk-celpopulatie waarin sommige cellen kunnen niet hebben ondergaan apoptosis.
CSCs of inleiding van de tumor cellen zijn geïdentificeerd in vele solide tumoren met een enkele of een combinatie van verschillende oppervlakte marker(s) en weinig nummers van deze cellen zijn voldoende om formulier tumoren in muizen immunodeficiëntie22,23,, 24,25,26,27. Een combinatie van CD44 en CD24 is vaak gebruikt in borst CSC studies en CD44+/CD24– cellen zijn gedefinieerd als de borst CSCs26,27,28,29 , 30. onlangs, wij hebben uitgevoerd een reeks experimenten om te bevestigen de voorgestelde relatie tussen apoptosis omkering en CSCs en aantonen dat omgekeerde borstkankercellen opgedaan meer tumor-vormende mogelijkheden in vitro en in vivo met een verhoogde percentage cellen met CSC markeringen18. Hoewel we niet uitsluiten kunnen dat borst CSCs beter overleven en dus na apoptosis omkering, vooral verrijkt krijgen wanneer we niet-stam kankercellen en onderwerp isoleren zal kunnen apoptosis omkering, CSC ontstaan in de oorspronkelijk niet-stam kanker-celpopulatie, suggereren dat niet-stam kanker cellen kunnen bijdragen tot de verhoging van het percentage van CSCs tijdens apoptosis omkering.
Dit artikel is bedoeld om aan te tonen van de overgang van niet-stam borstkankercellen naar borst CSC-achtige cellen na apoptosis omkering en deze overgang worden opgespoord door stroom cytometry. De borstkankercellen van niet-stam zijn aanvankelijk bereid door het isoleren van CD44–/CD24+ borstkanker kankercellen door FACS. Vervolgens is de apoptosis geïnduceerde en bevestigd door morfologische veranderingen onder de loep. Daarna zijn de apoptotic cellen positief gemerkt door Caspase-3/7 groen detectie kleurstof geïsoleerd door FACS en verder gekweekt in de afwezigheid van apoptotic inductoren voor apoptosis omkering. De omgekeerde cellen worden vervolgens gekleurd met CSC markeringen na 7 dagen van herstel voor flow cytometrische analyse. Cellen met CD44+/CD24– markeringen weer verschijnen in de omgekeerde bevolking, suggereren dat overgang van niet-stam kankercellen naar CSC-achtige cellen apoptosis omkering heeft geheerst.
Apoptosis omkering is waargenomen in meerdere kanker cellijnen evenals normale primaire cellen met verschillende apoptotic prikkels in vitro12,13behandeld. Dit proces is ook opgespoord in Drosophila model in vivo16,17,19. Veel informatie over het onderliggende mechanisme van kanker herval in verschillende kanker ziekte modellen en de oorsprong van CSCs kan worden verkregen door het gebruik van de techniek, zoals beschreven in dit manuscript.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een directe en duidelijke manier voor het opsporen van de overgang van niet-stam borstkankercellen in borst CSC-achtige cellen ten gevolge van apoptosis omkering. Bevestiging van de CSC-eigenschappen van deze omgekeerde cellen kan worden bijgestaan door ikn vitro mammosphere formatie assay en in vivo xenograft transplantatie in immunodeficiëntie muizen18,24,26 ,<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de innovatieve technologie Fonds voor innovatie technologie Commissie: financiering steun van de staat sleutel laboratorium voor Agrobiotechnology (CUHK), het Lo Kwee-Seong biomedisch onderzoeksfonds en de Lee Hysan Foundation. Y.X. werd gesteund door de postdoctorale studententijd van de CUHK.
Materials
| MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
| T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
| Reagent | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
| Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
| bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
| CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
| HEPES | USB | 16926 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
| monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
| monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
| paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
| PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
| phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
| propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
| Equipment | |||
| 100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
| 12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
| Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
| FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
| FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
| FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
| FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
| round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
| S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |
References
- McGuire, S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Advances in Nutrition. 7 (2), 418-419 (2015).
- Slamon, D. J., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New England Journal of Medicine. 344 (11), 783-792 (2001).
- Geyer, C. E., et al. Lapatinib plus capecitabine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2733-2743 (2006).
- Cameron, D., et al. A phase III randomized comparison of lapatinib plus capecitabine versus capecitabine alone in women with advanced breast cancer that has progressedon trastuzumab: updatedefficacy andbiomarker analyses. Breast Cancer Research and Treatment. 112 (3), 533-543 (2008).
- Liu, L. F. DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs. Annual Review of Biochemistry. 58, 351-375 (1989).
- Hertel, L. W., et al. Evaluation of the antitumor activity of gemcitabine (2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine). 암 연구학. 50 (14), 4417-4422 (1990).
- Ni, H., et al. Analysis of expression of nuclear factor kappa B (NF-kappa B) in multiple myeloma: downregulation of NF-kappa B induces apoptosis. British Journal of Haematology. 115 (2), 279-286 (2001).
- Richardson, P. G., Mitsiades, C., Hideshima, T., Anderson, K. C. Bortezomib: proteasome inhibition as an effective anticancer therapy. Annual Review of Medicine. 57, 33-47 (2006).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nature Review Drug Discovery. 9 (10), 790-803 (2010).
- Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nature Review Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).
- Pirozzi, G., et al. Prognostic value of cancer stem cells, epithelial-mesenchymal transition and circulating tumor cells in lung cancer. Oncology Reports. 29 (5), 1763-1768 (2013).
- Tang, H. L., Yuen, K. L., Tang, H. M., Fung, M. C. Reversibility of apoptosis in cancer cells. British Journal of Cancer. 100 (1), 118-122 (2009).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Molecular Biology of the Cell. 23 (12), 2240-2252 (2012).
- Xie, X., Wang, S. S., Wong, T. C. S., Fung, M. C. Genistein promotes cell death of ethanol-stressed HeLa cells through the continuation of apoptosis or secondary necrosis. Cancer Cell International. 13 (1), 63 (2013).
- Wang, S. S., Xie, X., Wong, C. S., Choi, Y., Fung, M. C. HepG2 cells recovered from apoptosis show altered drug responses and invasiveness. Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 13 (3), 293-300 (2014).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Harwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Scientific Reports. 5, 9015 (2015).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Hardwick, J. M., Fung, M. C. Strategies for tracking anastasis, a cell survival phenomenon that reverses apoptosis. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Xu, Y., So, C., Lam, H. M., Fung, M. C., Tsang, S. Y. Apoptosis reversal promotes cancer stem cell-like cell formation. Neoplasia. 20 (3), 295-303 (2018).
- Tang, H. M., Fung, M. C., Tang, H. L. Detecting anastasis in vivo by CaspaseTracker biosensor. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Li, J., Yuan, J. Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene. 27 (48), 6194-6206 (2008).
- Green, D. R., Amarante-Mendes, G. P. The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results and Problems in Cell Differentiation. 24, 45-61 (1998).
- Singh, S. K., et al. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors. 암 연구학. 63 (18), 5821-5828 (2003).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445 (7123), 111-115 (2007).
- O’Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Cioffi, M., et al. Identification of a distinct population of CD133(+) CXCR4(+) cancer stem cells in ovarian cancer. Scientific Reports. 5, 10357 (2015).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. 암 연구학. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Liu, S., et al. Breast cancer stem cells transition between epithelial and mesenchymal states reflective of their normal counterparts. Stem Cell Reports. 2 (1), 78-91 (2013).
- Sheridan, C., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast Cancer Research. 8 (5), R59 (2006).
- Phillips, T. M., McBride, W. H., Pajonk, F. The response of CD24(-/low)/CD44+ breast cancer-initiating cells to radiation. Journal of the National Cancer Institute. 98 (24), 1777-1785 (2006).
- Welshons, W. V., Wolf, M. F., Murphy, C. S., Jordan, V. C. Estrogenic activity of phenol red. Molecular and Cellular Endocrinology. 57 (3), 169-178 (1998).
- Tsuji, K., et al. Effects of Different Cell-Detaching Methods on the Viability and Cell Surface Antigen Expression of Synovial Mesenchymal Stem Cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nature Immunology. 7 (7), 681-685 (2006).
- Belmokhtar, C. A., Hillion, J., Ségal-Bendirdjian, E. Staurosporine induces apoptosis through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene. 20 (26), 3354-3362 (2001).
- Saunders, D. E., et al. Paclitaxel-induced apoptosis in MCF-7 breast-cancer cells. International Journal of Cancer. 70 (2), 214-220 (1997).
- Miller, A. V., et al. Paclitaxel-induced apoptosis is BAK-dependent, but BAX and BIM-independent in breast tumor. PLoS One. 8 (4), e60685 (2013).
- Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184 (1), 39-51 (1995).
- Ng, S. Y., et al. Role of voltage-gated potassium channels in the fate determination of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 165-177 (2010).
- Lo, I. C., et al. TRPV3 channel negatively regulates cell cycle progression and safeguards the pluripotency of embryonic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 403-413 (2016).
- Talanian, R. V., et al. Substrate specificities of caspase family proteases. Journal of Biological Chemistry. 272 (15), 9677-9682 (1997).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes & Development. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12 (5), 468-476 (2010).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Desiderio, V., et al. Increased fucosylation has a pivotal role in invasive and metastatic properties of head and neck cancer stem cells. Oncotarget. 6 (1), 71-84 (2015).
- Gupta, P. B., et al. Stochastic State Transitions Give Rise to Phenotypic Equilibrium in Populations of Cancer Cells. Cell. 146 (4), 633-644 (2011).
