כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון ולגלות עוד יותר את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד השד תאים סרטניים, כמו בתאי גזע לאחר היפוך אפופטוזיס מאת cytometry זרימה.
הישנות סרטן זמן נחקרה על ידי אונקולוגים בעוד המנגנון המשמש כבסיס אינן ברורות. לאחרונה, אנחנו ואחרים מצאו כי תופעה בשם אפופטוזיס היפוך מוביל tumorigenicity מוגברת בדגמי תא שונים תחת גירויים שונים. מחקרים קודמים כבר התמקדו מעקב אחר תהליך זה במבחנה, אין ויוו; עם זאת, הבידוד של תאים הפוכה ממש טרם ניתן להשיג, אשר מגביל את ההבנה שלנו על ההשלכות של היפוך אפופטוזיס. כאן, אנו לנצל צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7 לתאים תווית עם caspases מופעל לאחר מוות אינדוקציה. תאים עם אותות חיוביים מסודרים נוספת על ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) עבור שחזור. בדיקת מורפולוגיה תחת מיקרוסקופיה קונפוקלית מסייע לאשר את מצב אפופטוטיים להיפגע לפני FACS. עלייה tumorigenicity לעתים קרובות ניתן לייחס את העלאת באחוזים של תאי סרטן (CSC)-כמו תאים. כמו כן, לאור את הטרוגניות של סרטן השד, זיהוי המקור של תאים אלה CSC דמוי יהיה קריטי לטיפול בסרטן. לפיכך, אנו מכינים תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לפני מפעילה אפופטוזיס, לבודד תאים קספאז מופעל, ביצוע הליך היפוך אפופטוזיס. ניתוח cytometry זרימה מגלה כי תאים דמויי CSC בשד מחדש יופיעו בקבוצה הפוכה, המציין תאים דמויי CSC בשד הם transited מתאי גזע ללא סרטן השד במהלך היפוך אפופטוזיס. לסיכום, פרוטוקול זה כולל את ניתוקה של תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע וזיהוי של שינויים באחוזים CSC בתאים הפוכה על ידי cytometry זרימה.
סרטן כבר מובילה סיבת המוות, גורם מהווה נטל כלכלי כבד על מדינות ברחבי העולם1. סרטן השד מדרג גבוה מבחינת שכיחות ותמותה בחולים הנשי בין כל סוגי הסרטן1. בשל הטרוגניות סרטן, בשילוב של תרופות בדרך כלל משמש כימותרפיה כדי להשיג סרטן התא מוות2,3,4. עם זאת, מאז תרופות כימותרפיות נפוצים לעתים קרובות למקד דנ א5,6, חלבון סינתזה7,8 ו/או microtubule dynamics9, במהירות גוברת תאים הם מושפעים ביותר בזמן השבתה הדרגתית תאים כגון סרטן תאי גזע (CSC) s הם בדרך כלל פחות מושפעת10. CSCs הם, לפיכך, סביר יותר לשרוד לאחר הטיפול, כשבסופו מאוחר יותר עמידות לתרופות, סרטן נסיגה10,11. ומכאן, חיסול של CSCs הפך להיות נושא חשוב לטיפול בסרטן, המחקר על המקור של CSCs הוא הכרחי.
מחקרים נוספים על התופעה של אפופטוזיס היפוך בוצעו ב מהעשור האחרון12,13,14,15,16,17,18 , 19. לפני הופעתה של המושג הזה, זה נרחב התקבלה כי תאים בלתי הפיך עוברים אפופטוזיס לאחר קספאז ההפעלה. Caspases הם משפחה של אנזימים חלבונים ממלאים תפקידים מרכזיים בשלבים ייזום וביצוע של אפופטוזיס, כולל את היווצרות מוות מורכבים, את המחשוף של סובסטרטים במורד הזרם20. הפעלה של התליין caspases כגון קספאז 3 או קספאז 7 נחשב כמו “נקודת האל חזור” אפופטוזיס21. עם זאת, החוקרים לאחרונה הבחינו כי היפוך אפופטוזיס מופיעה במבחנה, ויוו, במהלך אילו תאים יכולים להתאושש אפופטוזיס גם לאחר קספאז הפעלה12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. יתר על כן, תכונות אגרסיביות כגון עמידות גבוהה יותר משרן אפופטוטיים להיפגע המקורי, invasiveness גבוהה יותר מזוהים ב סרטן הפוכה תאים15. לפיכך, הוצע כי אחוז תאים דמויי CSC יהיה גבוה יותר בקרב האוכלוסייה הפוך בהשוואה לתאי לא מטופל, בסופו של דבר לתרום התכונות מהעטלפים לאחר היפוך אפופטוזיס18.
בעבר, מאמצים רבים נעשו כדי לעקוב אחר אפופטוזיס היפוך במבחנה וחשוב יותר, אין ויוו, אשר במידה רבה לעזור המאשרת האוניברסליות של זה תהליך16,17,19. עם זאת, מחקר מערכתית על ההשלכות של תאים הפוכה לוקה בחסר בשל הבידוד משביעת רצון של תאים שעברו באמת היפוך אפופטוזיס. אין צורך לרכוש בתאים אפופטוטיים להיפגע טהור ולשחזר אותם ללימוד נוסף. לפיכך, אנו להשתמש בסמן באופן מסורתי מקובל היטב של התליין קספאז הפעלת הסמן של ה “נקודת האל חזור”21 של אפופטוזיס ולנצל תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) להפלות מופעל קספאז תאים צבעונית עם צבע זיהוי ירוק קספאז-3/7. לצבוע מקושר covalently רצף של חומצות אמיניות קצר, DEVD, אשר ניתן לזהות ביקע מאת פעיל caspases 3/7. המחשוף מסייעת לשחרור לצבוע, אשר translocate מ ציטוזול את הגרעין איפה זה נקשר ל- DNA ופולט קרינה פלואורסצנטית חזקה. נוהל זה מונע שימוש בצובר תא אוכלוסייה שבו כמה תאים עשויים לא עברו אפופטוזיס.
CSCs או תאי הגידול. מתחילה זוהו בגידולים מוצקים רבים באמצעות יחיד או שילוב של מספר marker(s) משטח ומספרים מעט מאוד של תאים אלה מספיקים כדי טופס גידולים עכברים immunodeficient22,23, 24,25,26,27. שילוב של CD44 CD24 כבר בשימוש נפוץ מחקרים השד CSC, CD44+/CD24– תאים הוגדרו השד CSCs26,27,28,29 , 30. לאחרונה, ערכנו סדרת ניסויים כדי לאשר את היחסים המוצע בין היפוך אפופטוזיס CSCs ומדגימים כי תאים סרטניים בשד הפוכה צבר מוגברת להיוות הגידול היכולת במבחנה ויוו עם אחוז גבוה של תאים עם סמנים CSC18. למרות שאנחנו לא יכול לכלול את האפשרות כי השד CSCs לשרוד טוב יותר, ובכך להשיג מועשר לאחר היפוך אפופטוזיס, חשוב, כאשר אנחנו לבודד תאים סרטניים שאינם-גזע ונושא אותם אפופטוזיס היפוך, CSC יתעוררו בגזע במקור הלא- אוכלוסיית תאים סרטן, רומז הלא-גזע סרטן תאים יכולים לתרום העלייה באחוזים של CSCs במהלך היפוך אפופטוזיס.
מאמר זה מטרתו להדגים את המעבר מתאי גזע ללא סרטן השד תאים דמויי CSC בשד לאחר היפוך אפופטוזיס, לזהות מעבר זה על-ידי cytometry זרימה. תאים שאינם-גזע סרטניים בשד מוכנים בתחילה על-ידי בידוד CD44–/CD24+ השד תאים סרטניים על ידי FACS. לאחר מכן, אפופטוזיס הוא המושרה, אושר על ידי שינויים מורפולוגיים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, בתאים אפופטוטיים להיפגע מתויג באופן חיובי על ידי צבע ירוק זיהוי קספאז 3/7 מבודדת על ידי FACS, תרבותי נוסף בהיעדר אפופטוטיים להיפגע inducers עבור היפוך אפופטוזיס. התאים הפוך ואז מוכתמים CSC סמני לאחר 7 ימים של החלמה לניתוח cytometric זרימה. תאים עם CD44+/CD24 סמנים– מחדש מופיעים באוכלוסייה הפוכה, רומז כי המעבר מתאי גזע ללא סרטן תאים דמויי CSC אירעה במהלך היפוך אפופטוזיס.
היפוך אפופטוזיס נצפתה סרטן מרובות שורות תאים, כמו גם תאים נורמליים העיקרי מטופלים עם גירויים שונים מוות חוץ גופית12,13. תהליך זה גם הוביל ב דרוזופילה דגם ויוו16,17,19. ניתן לקבל הרבה מידע לגבי המנגנון הבסיסי של relapse סרטן מודלים מחלות סרטן שונות, המקור של CSCs באמצעות הטכניקה כמתואר בכתב היד.
פרוטוקול זה מתאר שיטה ישירה וברורה לגילוי את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד לתאים CSC, כמו השד כתוצאה היפוך אפופטוזיס. אישור של CSC מאפייני תאים הפוכה אלה יכול להיות בסיוע באמצעות אניחוץ גופית n mammosphere היווצרות assay, ויוו xenograft השתלת עכברים immunodeficient18,24<…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי חדשני בטכנולוגיית קרן של חדשנות טכנולוגיה הנציבות: מימון תמיכה של המדינה מפתח מעבדה של Agrobiotechnology (CUHK), קרן מחקר Lo ביו Kwee-סאונג, קרן Hysan לי. Y.X. נתמכה על ידי studentship לתואר שני מ- CUHK.
MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
Reagent | |||
0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
HEPES | USB | 16926 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
Equipment | |||
100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |