Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.
Rezidiv wurde lange von Onkologen untersucht, während die zugrunde liegenden Mechanismen unklar bleiben. Vor kurzem fanden wir und andere, dass ein Phänomen namens Apoptose Umkehr zu erhöhten Tumorigenität in verschiedenen Zellmodellen unter verschiedene Reize führt. Frühere Studien konzentrierten sich auf die Verfolgung dieser Prozess in vitro und in vivo; ist aber noch die Isolierung der echten umgekehrte Zellen erreicht werden, welche Grenzen unser Verständnis über die Folgen der Apoptose Umkehr. Hier nutzen wir einen Caspase-3/7 Grün Erkennung Farbstoff Label Zellen mit aktivierte Caspasen nach Induktion der Apoptose. Zellen mit positiven Signalen werden weiter durch Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) zur Verwertung aussortiert. Morphologische Untersuchung unter konfokalen Mikroskopie hilft den apoptotischen stand vor FACS bestätigen. Eine Zunahme der Tumorigenität kann oft die Höhe des Anteils der Krebsstammzellen (CSC) zugeschrieben werden-wie Zellen. Auch wäre angesichts die Heterogenität der Brustkrebs, Identifizierung des Ursprungs dieser CSC-ähnliche Zellen entscheidend für die Behandlung von Krebs. So bereiten wir nicht Stamm Brustkrebszellen vor Apoptose auslösen, Caspase-aktivierten Zellen zu isolieren und die Apoptose Umkehrung Verfahren durchführen. Flow-Zytometrie-Analyse zeigt, dass die CSC-wie Brustzellen wieder erscheinen im Bereich “umgekehrte” darauf hinweist, dass die CSC-wie Brustzellen von Brustkrebszellen-Stamm während der Apoptose Umkehr gereist sind. Zusammenfassend lässt sich sagen enthält dieses Protokoll die Isolierung von apoptotischen Brustkrebszellen und Erkennung von Veränderungen in CSC Prozentsatz in umgekehrter Zellen durch Durchflusszytometrie.
Krebs ist eine führende Ursache des Todes, verursacht schwere Last zu Ländern weltweit1gewesen. Brustkrebs zählt bei weiblichen Patienten unter allen Arten von Krebs1hoch, sowohl in Bezug auf die Inzidenz und Mortalität. Aufgrund der Heterogenität Krebs ist eine Kombination von Medikamenten in der Regel in der Chemotherapie verwendet, um Krebs Zelle Tod2,3,4zu erreichen. Jedoch da gemeinsame Chemotherapeutika oft DNA-5,6 Ziel, betroffen Synthese7,8 und/oder Mikrotubuli Proteindynamik9, schnell wachsende Zellen sind am meisten während ruhende Zellen wie Krebs-Stammzellen (CSC) s sind in der Regel weniger betroffenen10. CSCs sind daher eher nach der Behandlung überleben, später führt zu Resistenzen und Krebs10,11 Rezidiv. Daher, Beseitigung von CSCs ist ein wichtiges Thema für die Krebsbehandlung geworden und Studie über den Ursprung des CSCs ist notwendig.
Weitere Studien über das Phänomen der Apoptose Umkehrung wurden im letzten Jahrzehnt12,13,14,15,16,17,18 durchgeführt , 19. vor der Entstehung dieses Konzeptes, es hat weit angenommen worden, dass Zellen irreversibel nach der Aktivierung der Caspase Apoptose. Caspasen sind eine Familie von Protein-Enzyme, die wichtige Rolle in der Initiierung und Durchführung Stadien der Apoptose, einschließlich der Bildung von komplexen apoptotische und die Spaltung von nachgelagerten Substrate20spielen. Aktivierung von Caspasen Henker wie Caspase 3 oder Caspase 7 galt als der “Point Of No Return” für Apoptose21. Allerdings beobachteten Forscher vor kurzem, dass Umkehr Apoptose sowohl in-vitro tritt- und in-vivo, , während die Zellen sich von Apoptose auch nach Caspase Aktivierung12,13,14 erholen können , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Darüber hinaus aggressive Merkmale wie z. B. höhere Beständigkeit gegen die ursprünglichen Apoptose-Induktor und höheren Invasivität werden in der umgekehrten Krebs erkannt Zellen15. Daher wurde vorgeschlagen, dass der Anteil der CSC-ähnlichen Zellen in der umgekehrten Bevölkerung im Vergleich zu den unbehandelten Zellen schließlich einen Beitrag zu mehr bösartigen Funktionen nach Apoptose Umkehr18höher wäre.
Zuvor wurden viele Anstrengungen unternommen, die Apoptose Umkehr in-vitro- und noch wichtiger, in vivo zu verfolgen die sehr helfen bei der Bestätigung der Universalität von diesem Prozess16,17,19. Allerdings fehlt eine systemische Studie über die Folgen der umgekehrte Zellen aufgrund der unbefriedigenden Isolation von Zellen, die wirklich Apoptose Umkehr unterzogen wurden. Es muss eine reine Apoptotic Zellen zu erwerben und für weitere Studien zu erholen. Also, wir verwenden den traditionell anerkannten Marker der Henker Caspase Aktivierung als Marker für den “Point Of No Return”-21 für die Apoptose und nutzen Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) um Caspase-aktivierten Zellen befleckt Diskriminierung mit Farbstoff Caspase-3/7-Grün-Erkennung. Der Farbstoff ist kovalent verbunden mit eine kurze Aminosäuresequenz, DEVD, die erkannt und durch aktive Caspasen 3/7 abgespalten werden können. Die Spaltung hilft den Farbstoff freigeben, die aus dem Zytosol in den Zellkern translozieren wird, wo es bindet an DNA und starke Fluoreszenz emittiert. Dieses Verfahren vermeidet die Verwendung einer Bulk-Zell-Population, in der einige Zellen keine Apoptose durchgemacht haben können.
CSCs oder Tumor-initiierenden Zellen wurden in vielen soliden Tumoren, die mit einer einzigen oder eine Kombination aus mehreren Oberflächen Marker(s) und sehr wenige Zahlen dieser Zellen sind ausreichend, um Form Tumoren immungeschwächte Mäuse22,23, 24,25,26,27. Häufig wird eine Kombination von CD44 und CD24 Brust CSC Studien und CD44+/CD24– Zellen wurden definiert als die Brust CSCs26,27,28,29 , 30. vor kurzem haben wir eine Reihe von Experimenten bestätigen die vorgeschlagene Beziehung zwischen Apoptose Umkehr und CSCs zu demonstrieren, dass umgekehrte Brustkrebszellen erhöhte Tumor bilden Fähigkeit in vitro und in vivo mit gewonnen durchgeführt ein erhöhter Anteil an Zellen mit CSC Marker18. Obwohl wir nicht ausschließen konnte, dass Brust CSCs besser überleben und somit nach Apoptose Umkehr, wichtig ist, bereichert wenn wir nicht-Stamm Krebszellen und Thema isolieren entstehen ihnen zu Apoptose Umkehr, CSC in der ursprünglich nicht-stem Krebs-Zell-Population, darauf hindeutet, dass nicht-Stammzellen Krebs, wie Zellen auf die Erhöhung des Anteils von CSCs während der Apoptose Umkehr beitragen können.
Dieser Artikel soll den Übergang von Brustkrebszellen-Stamm zu CSC-wie Brustzellen nach Apoptose Umkehr zu zeigen und diesen Übergang durch Durchflusszytometrie zu erkennen. -Stamm-Brustkrebszellen bereiten wir zunächst durch die Isolierung von CD44–/CD24+ Brustkrebs Krebszellen durch FACS. Dann ist Apoptose induziert und durch morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop bestätigt. Danach sind Apoptotic Zellen positiv gekennzeichnet durch Caspase 3/7 Grün Erkennung Farbstoff durch FACS isoliert und weiter in das Fehlen von Apoptose induzieren Apoptose Umkehr kultiviert. Die umgekehrten Zellen sind dann nach 7 Tagen Erholung für durchflusszytometrischen Analyse mit CSC-Markern gefärbt. Zellen mit CD44+/CD24– Marker erscheinen wieder in der umgekehrten Bevölkerung darauf hindeutet, dass Übergang von nicht-Stamm Krebszellen zu CSC-wie Zellen in Apoptose Umkehrung aufgetreten ist.
Apoptose Umkehr wurde in mehreren Krebs beobachtet Zelllinien sowie normale Primärzellen mit verschiedenen apoptotischen Stimuli in vitro-12,13behandelt. Dieser Prozess hat auch in Drosophila verfolgt worden Modell in-vivo16,17,19. Viele Informationen über die zugrunde liegenden Mechanismus der Krebs-Rückfall in verschiedenen Krebs-Krankheit-Modelle und die Herkunft des CSCs erhalten Sie durch den Einsatz der Technik wie in diesem Manuskript beschrieben.
Dieses Protokoll beschreibt eine direkte und klare Weise zur Erkennung von den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen in Brust CSC-ähnliche Zellen infolge Apoptose Umkehr. Bestätigung der CSC Eigenschaften dieser umgekehrte Zellen könnte gefördert werden, mit der ichn Vitro Mammosphere Bildung Assay und in Vivo Xenograft-Transplantation in immungeschwächte Mäuse18,24,26 ,…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Innovative Technologie der Innovation Technologie Kassenkommission: Finanzierung Unterstützung durch den Staat Schlüssel Labor der Agrobiotechnologie (CUHK), Lo Qixi-Seong Biomedical Research Fund und Lee Hysan Foundation. Y.X. wurde von der postgradualen Zugehörigkeit aus der CUHK unterstützt.
MCF-7 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-22 | |
MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-26 | |
T47D | American Type Culture Collection (ATCC) | HTB-133 | |
Reagent | |||
0.05% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300054 | |
0.25% trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200072 | |
Alexa Fluor 680 annexin V conjugate | Invitrogen | A35109 | |
bovine serum albumin | USB | 9048-46-8 | |
CaCl2 · 2H2O | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
CellEvent caspase-3/7 green fluorescent dye | Invitrogen | C10423 | |
dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fc block | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
fetal bovine serum | Invitrogen | 16000044 | heat-inactivated |
HEPES | USB | 16926 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | |
L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
Mitotracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | |
monoclonal antibodies against human CD24 | BD Biosciences | 555428 | PE Clone:ML5 Lot:5049759 RRID:AB_395822 |
monoclonal antibodies against human CD44 | BD Biosciences | 560531 | PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lot:7230770 RRID:AB_1727485 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 31434 | |
paclitaxel | Sigma-Aldrich | T7402 | |
PE Mouse IgG2a, κ Isotype Control | BD Biosciences | 554648 | Clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491 |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 558304 | Clone:27-35 RRID:AB_647257 |
phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 21600010 | |
propidium iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium | Invitrogen | 11835055 | phenol red-free |
sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
staurosporine | Sigma-Aldrich | S4400 | |
Equipment | |||
100 mm culture dish | Greiner Bio-One | 664160 | |
12-well tissue culture plates | Thermo Fisher Scientific | 150628 | |
Cell Strainer 40-μm nylon mesh | BD Biosciences | 08-771-1 | |
FACSuite software bundle v1.0 | BD Biosciences | 651360 | |
FACSVerse | BD Biosciences | 651155 | |
FluoView FV1000 confocal microscope | Olympus | IX81 | 60X objective |
FV10-ASW Viewer software Ver.4.2b | Olympus | – | |
round-bottom polystyrene 12 × 75 mm tubes | BD Biosciences | 352003 | |
S3e sorter | Bio-Rad | 1451006 |