JoVE Journal > Cancer Research
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암 연구학

Paramyxoviruses para imunomodulação Tumor-alvo: Design e avaliação Ex Vivo

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58651
,
1Department of Translational Oncology,German Cancer Research Center (DKFZ) and National Center for Tumor Diseases (NCT), 2Faculty of Biosciences,Heidelberg University, 3Department of Medical Oncology,NCT and Heidelberg University Hospital

Summary

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho detalhado para a geração e ex vivo caracterização de vírus Oncolíticos para expressão de imunomoduladores, usando vírus de sarampo codificação participantes de célula T bispecific como exemplo. Aplicação e adaptação para outras plataformas de vetor e transgenes irão acelerar o desenvolvimento do romance immunovirotherapeutics de tradução clínica.

Abstract

Bem sucedida imunoterapia tem potencial para alcançar controle de tumor a longo prazo. Apesar dos sucessos clínicos recentes, ainda há uma necessidade urgente de terapias seguras e eficazes, adaptados para imune perfis individuais do tumor. Vírus Oncolíticos permitem a indução de respostas imunes de anti-tumor, bem como a expressão do gene tumor restrito. Este protocolo descreve a geração e ex vivo análise de imunomoduladores Oncolíticos vetores. Enfocando o vírus de sarampo vacina codificação participantes de célula T bispecific como exemplo, a metodologia geral pode ser adaptada para outras espécies de vírus e transgenes. O fluxo de trabalho apresentado inclui o projeto, clonagem, resgate e propagação de vírus recombinantes. Ensaios para analisar a cinética de replicação e atividade lítica do vetor, bem como a funcionalidade do imunomodulador isolado ex vivo são incluídos, facilitando assim a geração de novos agentes para o desenvolvimento em modelos pré-clínicos e, finalmente, Tradução clínica.

Introduction

Vírus Oncolíticos (OVs) estão sendo desenvolvidos como terapêutica anticâncer que especificamente replicar dentro e matar as células do tumor, deixando os tecidos saudáveis intactas. Tornou-se comum de entendimento que virotherapy Oncolíticos (OVT), na maioria dos casos, não depende unicamente da lise completa tumor por replicação eficiente e propagação do vírus, mas requer mecanismos adicionais de ação para o sucesso do tratamento, incluindo vascular e do estroma direcionamento e, importante, estimulação imune1,2,3,4. Enquanto muitos estudos iniciais de OV usado sem modificações de vírus, pesquisa atual lucrou com um biológico melhorado compreensão, biobancos de vírus que potencialmente contêm romance OVs e as possibilidades oferecidas pela engenharia genética para criar OV avançado plataformas de6,5,7.

Tendo em conta o recente sucesso da imunoterapia, imunomodulador transgenes são de particular interesse sobre a engenharia genética de OVs. Expressão alvo desses produtos do gene por células tumorais OV infectadas reduz toxicidade comparada a administração sistémica. Segmentação é conseguido usando vírus com oncoselectivity inerente ou modificando o tropismo viral8. Imunomodulação local aprimora os mecanismos de anti-tumor multi-facetada de OVT. Além disso, esta estratégia é instrumental em interrogar a interação entre vírus, células tumorais e o sistema imunológico do hospedeiro. Para este fim, este protocolo fornece um fluxo de trabalho aplicável e ajustável para projetar, clonar, resgatar, propagar e validar Oncolíticos vetores de paramixovírus (especificamente vírus do sarampo) codificação tais transgenes.

Modulação da resposta imune pode ser alcançada por uma grande variedade de produtos de transgene como alvo diferentes passos do câncer-imunidade ciclo9, incluindo a reforçar o reconhecimento do antígeno de tumor [por exemplo, antígenos tumor-associado (TAAs) ou indutores de complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas] ao longo de maturação de células dendríticas de apoio para apresentação de antigénios eficiente (citocinas); recrutamento e ativação de células imunes desejadas como citotóxicas e auxiliar T células [quimiocinas, participantes de célula T de bispecific (BTEs)]; segmentação supressivas células tais como pilhas de T reguladoras, células supressoras mieloide-derivado, tumor-associado de macrófagos e fibroblastos associada a câncer (anticorpos, BTEs, citocinas); e prevenção da inibição de células efetoras e exaustão (inibidores de ponto de verificação). Assim, uma infinidade de agentes biológicos está disponível. Avaliação de tais vírus codificado imunomoduladores em relação a eficácia terapêutica e as sinergias possíveis, bem como a compreensão dos respectivos mecanismos é necessária melhorar a terapia do câncer.

Vírus de RNA sentido negativo single-stranded da família Paramyxoviridae caracterizam-se por várias características favoráveis ao seu uso como Oncolíticos vetores. Estes incluem um oncotropism natural, grande capacidade genômica de transgenes (mais de 5KB)10,11, eficiente propagação incluindo formação de citoplasma e alta imunogenicidade12. Portanto, plataformas OV baseadas na cinomose vírus13, caxumba vírus14, doença de Newcastle vírus15, vírus Sendai16,17, simian virus 518e Tupaia paramixovírus19 têm sido desenvolvidos. Viva mais proeminente, vacina de vírus atenuado do sarampo cepas (MV) progrediram em desenvolvimento pré-clínico e clínico20,21. Estas estirpes de vírus têm sido utilizados há décadas para a imunização de rotina com uma segurança excelente registro22. Além disso, não há nenhum risco de mutagênese insercional devido a replicação estritamente citosólica do paramyxoviruses. Um sistema de genética reversa versátil baseado em antigenômica do cDNA que permite a inserção dos transgenes em unidades adicionais de transcrição (ADO) é disponível11,23,24. Vetores de MV codificação-iodeto de sódio symporter (MV-NIS) para geração de imagens e radioterapia ou antígeno carcinoembryonic solúvel (MV-CEA) como um marcador substituto para expressão gênica viral atualmente estão sendo avaliados em ensaios clínicos (NCT02962167, NCT02068794, NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 e NCT00408590). Administração de segura tenha sido confirmada e foram notificados casos de eficácia anti-tumoral em anteriores estudos25,26,,27,28,29, 30 (revisado por Msaouel et al.31), abrindo caminho para o vírus do sarampo Oncolíticos adicionais que foram desenvolvidos e testados pré-clínicos. MV codificação immunomodulatory moléculas alvo diversas etapas do ciclo de câncer-imunidade têm sido mostradas para atrasar o crescimento do tumor e/ou prolongar a sobrevivência em ratos, com evidências de eficácia imune-mediada e a longo prazo memória imunológica protetora em syngeneic modelos do rato. Vector-codificado transgenes incluem colônia de Granulócito-macrófago factor (GM-CSF)32,33, H. pylori neutrófilos-ativando proteína34, inibidores de checkpoint imune35, Interleucina-12 (IL-12)36, TAAs37e BTEs38, que um antígeno de superfície do tumor com CD3 cross-link e, assim, induzir a atividade antitumoral por pilhas de T policlonais, independentemente do receptor de células T especificidade e estimulação co ( A Figura 1). Os resultados promissores pré-clínicos obtidos para essas construções ainda mais esforços translacional de demanda.

Talimogene laherparepvec (T-VEC), um tipo vírus de herpes simples codificação GM-CSF, é o único Oncolíticos terapêutico aprovado pelo Estados Unidos, Food e Drug Administration (FDA) e Agência Europeia de medicamentos (EMA). O estudo de fase III levando a aprovações no final 2015 não mostrou apenas eficácia no local da injeção intra-tumoral, mas também efeitos de abscopal (ou seja, a remissão das lesões não injectada) melanoma avançado39. T-VEC entrou desde ensaios adicionais para aplicação em outras entidades do tumor (por exemplo, câncer de pele não-melanoma de, , NCT03458117; câncer de pâncreas, NCT03086642) e para avaliação de terapias de combinação, especialmente com o posto de controle imune inibidores (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 e Ribas et al.40).

Isso demonstra não apenas o potencial da imunoterapia Oncolíticos, mas também a necessidade de mais pesquisas identificar combinações superiores de OVT e imunomodulação. Projeto racional de vetores adicionais e seu desenvolvimento para testes pré-clínicos é a chave para esta empresa. Isto também vai avançar a compreensão dos mecanismos subjacentes e tem implicações para a progressão para o tratamento de câncer mais personalizado. Para este fim, esta publicação apresenta a metodologia para a modificação e o desenvolvimento do paramyxoviruses para imunoterapia específica e, mais especificamente, do vírus de sarampo Oncolíticos codificação de célula T-engajar-se anticorpos (Figura 2).

Protocol

Nota: [O], [P] e [M] indicar aplicáveis às subseções: OVs, em geral, (a maioria) paramyxoviruses ou MV, respectivamente. [B] indica seções específicas para BTE transgenes. 1 clonagem de Transgenes imunomodulador-codificação em vetores de vírus do sarampo [O] design Insira a sequência. [O] decidir sobre um imunomodulador de interesse com base na pesquisa de literatura ou em dados exploratórios como telas genética<sup class="xre…

Representative Results

A Figura 1 ilustra o mecanismo de ação do vírus de sarampo Oncolíticos codificação bispecific célula T participantes. Um fluxograma descrevendo o fluxo de trabalho do presente protocolo é apresentado na Figura 2. A Figura 3 mostra um exemplo de um genoma do vírus de sarampo Oncolíticos modificados. Isso fornece uma representação visual das mudanças específicas aplicada…

Discussion

Oncolíticos imunoterapia (i. e., OVT em combinação com imunomodulação) é uma grande promessa para tratamento de câncer, exigindo ainda mais desenvolvimento e otimização de vírus Oncolíticos codificação immunomodulatory proteínas. Este protocolo descreve métodos para gerar e validar tais vetores para testes subsequentes em modelos pré-clínicos relevantes e potencial futura tradução clínica em novela terapêutica anticâncer.

Inúmeras plataformas de vírus Oncolíti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esses métodos foram estabelecidos no grupo Virotherapy, liderado pelo Prof Dr. Dr. Guy Ungerechts no centro nacional para doenças tumorais em Heidelberg. Estamos em dívida para com ele e todos os membros da equipe do laboratório, especialmente Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler e Jessica Albert. Este trabalho foi apoiado pela outra Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 ao C.E. Engelen) e Fundação de ciência nacional alemã (DFG, conceder EN 1119/2-1 ao C.E. Engelen). J.P.W. Heidbuechel recebe um estipêndio pela escola de pós-graduação Internacional de Helmholtz para pesquisa do câncer.

Materials

Rapid DNA Dephos & Ligation Kit Roche Life Science, Mannheim, Germany 4898117001
CloneJET PCR Cloning Kit Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot K1231
Agarose Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany A9539-500G
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN, Hilden, Germany 28704
NEB 10-beta Competent E. coli New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany C3019I
LB medium after Lennox Carl Roth, Karlsruhe, Germany X964.1
Ampicillin Carl Roth, Karlsruhe, Germany HP62.1
QIAquick Miniprep Kit QIAGEN, Hilden, Germany 27104
Restriction enzyme HindIII-HF New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany R3104S
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Invitrogen, Darmstadt, Germany 31966-021
Fetal bovine serum (FBS) Biosera, Boussens, France FB-1280/500
FugeneHD Promega, Mannheim, Germany E2311 may be replaced by transfection reagent of choice
Kanamycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany K0129
Vero cells ATCC, Manassas, VA, USA CCL81
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg available upon request
Granta-519 DSMZ, Braunschweig, Germany ACC 342
Opti-MEM (serum-free medium) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 31985070
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) PromoKine, Heidelberg, Germany PK-CA20-300-1000 includes XTT reagent
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany 14190-094
QIAquick Ni-NTA Spin Columns QIAGEN, Hilden, Germany 31014
Sodium chloride Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.3
Imidazole Carl Roth, Karlsruhe, Germany I5513-25G
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa Merck, Darmstadt, Germany UFC901024
BCA Protein Assay Kit Merck Milipore 71285-3
IgG from human serum Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany I4506
Anti-HA-PE Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-092-257 RRID: AB_871939
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody BD Biosciences, Heidelberg, Germany 555749 RRID: AB_396091
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany 12158167001 RRID: AB_390915
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-090-485
MS Columns Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-201
MiniMACS Separator Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-102
MACS MultiStand Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany 130-042-303
RIPA buffer Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA MB-030-0050
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Promega, Mannheim, Germany G1780 includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution
Cell lifter Corning, Reynosa, Mexico 3008
10 cm dishes Corning, Oneonta, NY, USA 430167
15 cm dishes Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 639160
96-well plates, U-bottom TPP, Trasadingen, Switzerland 92097
96-well plates, flat bottom Neolab, Heidelberg, Germany 353072
6-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353046
12-well plates Neolab, Heidelberg, Germany 353043
50 mL tubes nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany 02-572-3001
T175 cell culture flasks Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot 159910
0.22 µm filters Merck, Darmstadt, Germany SLGPM33RS
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Heidbuechel, J. P., Engeland, C. E. Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo. J. Vis. Exp. (143), e58651, doi:10.3791/58651 (2019).
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