Bu iletişim kuralı ex vivo karakterizasyonu immunomodulators, kızamık virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama kullanarak ifade oncolytic virüslerin ve nesil için ayrıntılı bir iş akışı açıklar. Uygulama ve uyarlama diğer vektör platformları ve transgenes klinik çeviri için roman immunovirotherapeutics gelişimi hızlanır.
Başarılı kanserli hastalarda uzun süreli tümör kontrolü elde etmek için potansiyeli vardır. Son klinik başarılara rağmen bireysel tümör bağışıklık profillerine uygun güvenli ve etkili tedaviler için acil bir ihtiyaç kalır. Oncolytic virüs anti-tümör bağışıklık yanıtı hem de tümör sınırlanmış gen ekspresyonu indüksiyon etkinleştirin. Bu iletişim kuralı immunomodulatory oncolytic vektörler üretimi ve ex vivo analizini açıklar. Kızamık aşı virüs bispecific T hücre engagers örnek olarak kodlama odaklanan, diğer virüs türler ve transgenes genel metodoloji adapte edilebilir. Sunulan iş akışı tasarımı, klonlama, kurtarma ve rekombinant virüslerin yayılmasını içerir. Kinetik ve Yöneyin litik aktivite yanı sıra ex vivo izole Immünomodülatör işlevselliğini çözümlemek için deneyleri dahil, böylece roman ajanlar üretimi daha da geliştirilmesi preklinik modelleri için kolaylaştırmak ve sonuçta klinik çeviri.
Oncolytic virüs (OVs) özellikle içinde çoğaltmak ve sağlıklı dokulara olduğu gibi bırakarak tümör hücrelerini öldürmek anti-kanser tedavi olarak geliştirilmektedir. Bu, şimdi bu oncolytic virotherapy (OVT), çoğu durumda anlama yaygın hale gelmiştir yalnızca tam Tümör lizis verimli yineleme ve yayılan virüs tarafından dayanmaz ancak tedavi başarı için ek mekanizmaları eylem gerektirir dahil olmak üzere vasküler ve stromal hedefleme ve daha da önemlisi, immün stimülasyon1,2,3,4. Birçok erken OV çalışma değiştirilmemiş virüs kullanılan iken, mevcut araştırma anlama, potansiyel olarak Roman OVs ve gelişmiş OV oluşturmak için genetik mühendisliği tarafından sunulan olanakları içeren virüs biobanks geliştirilmiş bir biyolojik kazançlı platformlar5,6,7.
İmmünoterapi son başarısı göz önüne alındığında, OVs. genetik mühendisliği ile ilgili özel ilgi immunomodulatory transgenes vardır Tür gen ürünlerin OV-enfekte tümör hücreleri tarafından hedeflenen ifade için sistemik yönetim karşılaştırıldığında toksisite azaltır. Hedefleme ile doğal oncoselectivity virüs kullanarak veya viral tropism8değiştirme elde edilir. Yerel immunomodulation OVT çok yönlü anti-tümör mekanizmalarının geliştirir. Ayrıca, bu virüs, tümör hücreleri ve ana bağışıklık sistemi arasında Interplay sorguya enstrümantal bir stratejidir. Bu amaçla, bu iletişim kuralını tasarlama, clone, kurtarmak, yaymak ve oncolytic paramyxovirus (özellikle kızamık virüsü) vektörel çizimler böyle transgenes kodlama doğrulamak için bir uygulanabilir ve ayarlanabilir iş akışı sağlar.
Modülasyon bağışıklık yanıtının çok çeşitli kanser-bağışıklık döngüsü9tümör antijen tanıma [Örneğin, tümör ilişkili antijenleri (TAAs) veya indükleyicileri, geliştirilmesi de dahil olmak üzere, farklı adımları hedefleme transgene ürünleri tarafından elde edilebilir MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri] dendritik hücre olgunlaşma verimli antijen sunumu (sitokinler); destekleyen üzerinde işe alma ve istenen bağışıklık hücreleri gibi etkinleştirme sitotoksik ve yardımcı T hücreleri [kemokinler, bispecific T hücre engagers (BTEs)]; hedefleme süpresif hücreleri gibi düzenleyici T hücreleri, myeloid kaynaklı bastırıcı hücreler, makrofajlar tümör ilişkili ve kanser ilişkili fibroblastlar (antikorlar, BTEs, sitokinler); ve efektör hücre inhibisyonu ve bitkinlik (denetim noktası inhibitörleri) önlenmesi. Böylece, bir bolluk biyolojik ajanlar kullanılabilir. Bu tür virüs kodlanmış immunomodulators terapötik etkinlik ve olası sinerji ile ilgili olarak hem de kendi mekanizmaları anlama değerlendirilmesi kanser tedavisi geliştirmek gereklidir.
Negatif anlamda tek iplikçikli RNA virüsleri Paramyxoviridae ailesine oncolytic vektör olarak çeşitli özellikler bunların kullanımı için elverişli karakterizedir. Bunlar doğal oncotropism, transgenes (daha–dan 5 kb)10,11, syncytia formasyonu ve yüksek immünojenisite12gibi yayılan verimli geniş genomik kapasite bulunmaktadır. Bu nedenle, Canine distemper virüs13, kabakulak virüsü14, Newcastle hastalığı virüsü15, Sendai virüs16,17, simian virüs 518ve Tupaia paramyxovirus19 temel OV platformlar geliştirilmiştir. En belirgin, canlı zayıflatılmış kızamık virüsü aşı suşları (MV) preklinik ve klinik geliştirme20,21‘ ilerlemiştir. Bu virüs suşları bir mükemmel Emanet kayıt22ile rutin aşılama için yıllardır kullanılmaktadır. Ayrıca, paramyxovirusler kesinlikle sitozolik çoğaltma nedeniyle insertional mutagenesis için hiçbir risk yok. Transgenes ek transkripsiyon birimleri (ATUs) içine ekleme için sağlayan Anti-genomik cDNA dayalı bir çok yönlü ters genetik sistem mevcut11,23,24‘ tür. Sodyum iyodür simporter (MV-NIS) viral gen ifadesinin bir surrogate marker olarak görüntüleme ve radyoterapi veya çözünür carcinoembryonic antijen (MV-CEA) için kodlama MV vektörel çizimler klinik deneylere (NCT02962167, NCT02068794, şu anda değerlendirilen NCT02192775, NCT01846091, NCT02364713, NCT00450814, NCT02700230, NCT03456908, NCT00408590 ve NCT00408590). Güvenli yönetim doğruladı ve vaka anti-tümör etkinliğinin önceki çalışmalar25,26,27,28,29, rapor 30 (Msaouel et al.31tarafından gözden geçirilmiş), ek oncolytic kızamık virüs, geliştirilen ve preclinically test için önünü. Kanser-bağışıklık döngüsünün farklı adımları hedefleme molekülleri tümör büyüme gecikme ve/veya immün aracılı etkinlik ve uzun süreli koruyucu bağışıklık bellekte syngeneic için kanıt ile fareler, hayatta kalma uzatmak için gösterilen immunomodulatory kodlama MV fare modelleri. Transgenes vektör kodlamalı granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF)32,33, H. pylori nötrofil aktive protein34, bağışıklık denetim noktası inhibitörleri35dahil, İnterlökin-12 (IL-12)36, TAAs37ve BTEs38, hangi bir tümör bölünmelerini CD3 ile HCV ve bu nedenle anti-tümör faaliyet T hücre reseptör özgüllük ve Co stimülasyon (bakılmaksızın poliklonal T hücreleri tarafından neden Şekil 1). Bu yapıları talep daha fazla translasyonel çabaları için elde edilen umut verici preklinik sonuçları.
Talimogene laherparepvec (T-VEC), bir tür ben GM-CSF, kodlama herpes simpleks virüsü tek oncolytic tedavi Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanmış olduğunu. Onayları için geç 2015 yılında önde gelen Faz III çalışmada yalnızca gelişmiş melanom39etkinlik içi tumoral enjeksiyon, aynı zamanda abscopal etkileri (yani, remisyon sigara enjekte lezyonların) yerinde gösterilen değil. T-VEC beri ek denemeler kombinasyonu terapileri, özellikle bağışıklık denetim noktası ile değerlendirilmesi ve uygulama diğer tümör varlıklarda (örneğin, Sigara Melanom cilt kanseri, NCT03458117; pankreas kanseri, NCT03086642) için girdi inhibitörleri (NCT02978625, NCT03256344, NCT02509507, NCT02263508, NCT02965716, NCT02626000, NCT03069378, NCT01740297 ve Ribas et al.40).
Bu sadece da OVT ve immunomodulation üstün birleşimlerini tanımlamak daha fazla araştırma ihtiyacını oncolytic immünoterapi potansiyelini gösterir. Ek vektörel çizimler ve preklinik test etmek için geliştirme rasyonel tasarım bu girişim için anahtardır. Bu da temel mekanizmaları anlayışı ilerletmek ve daha fazla kişiselleştirilmiş kanser tedavisi doğru ilerleme için sonuçları vardır. Bu amaçla, bu yayın için değişiklik ve geliştirme için hedeflenen kanserli hastalarda paramyxovirusler ve daha ayrıntılı olarak, oncolytic kızamık virüs T hücre ilgi çekici antikorlar (Şekil 2) kodlama yöntemi sunar.
Oncolytic immünoterapi (i.e., immunomodulation ile birlikte OVT) kanser tedavisi, daha da geliştirilmesi ve optimizasyonu immunomodulatory protein kodlama oncolytic virüslerin talep için büyük söz sahibidir. Bu iletişim kuralı oluşturmak ve ilgili preklinik modelleri ve potansiyel gelecek klinik çeviri roman anti-kanser tedavi içine sonraki test etmek için böyle vektörel çizimler doğrulamak için yöntemler açıklanır.
Çok sayıda farklı oncolytic virüs farklı a…
The authors have nothing to disclose.
Bu yöntemler Virotherapy tümör hastalıkları Heidelberg için Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts Ulusal Merkezi liderliğindeki grup kuruldu. Biz onu ve laboratuvar ekibi, özellikle Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler ve Jessica Albert tüm üyeleri için borçlu bulunmaktadır. Bu eser başka Kröner-Fresenius-Stiftung tarafından desteklenmiştir (Grant 2015_A78 CE Engeland için) ve Alman Ulusal Bilim Vakfı (DFG, C.E. Engeland için EN 1119/2-1 vermek). J.P.W. Heidbuechel bir maaşa Helmholtz International Graduate School tarafından kanser araştırmaları için alır.
Rapid DNA Dephos & Ligation Kit | Roche Life Science, Mannheim, Germany | 4898117001 | |
CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
Agarose | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A9539-500G | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 28704 | |
NEB 10-beta Competent E. coli | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | C3019I | |
LB medium after Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | X964.1 | |
Ampicillin | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | HP62.1 | |
QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germany | 27104 | |
Restriction enzyme HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Frankfurt/Main, Germany | R3104S | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germany | 31966-021 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Biosera, Boussens, France | FB-1280/500 | |
FugeneHD | Promega, Mannheim, Germany | E2311 | may be replaced by transfection reagent of choice |
Kanamycin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | K0129 | |
Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | available upon request | |
Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
Opti-MEM (serum-free medium) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germany | PK-CA20-300-1000 | includes XTT reagent |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 14190-094 | |
QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germany | 31014 | |
Sodium chloride | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.3 | |
Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germany | UFC901024 | |
BCA Protein Assay Kit | Merck Milipore | 71285-3 | |
IgG from human serum | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | I4506 | |
Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
Mouse IgG1, kappa Isotype Control, Phycoerythrin Conjugated, Clone MOPC-21 antibody | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 555749 | RRID: AB_396091 |
Anti-HA-biotin antibody, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-090-485 | |
MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-201 | |
MiniMACS Separator | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-102 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-303 | |
RIPA buffer | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay | Promega, Mannheim, Germany | G1780 | includes 10x lysis solution, substrate solution (substrate mix and assay buffer), and stop solution |
Cell lifter | Corning, Reynosa, Mexico | 3008 | |
10 cm dishes | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 | |
15 cm dishes | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 639160 | |
96-well plates, U-bottom | TPP, Trasadingen, Switzerland | 92097 | |
96-well plates, flat bottom | Neolab, Heidelberg, Germany | 353072 | |
6-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353046 | |
12-well plates | Neolab, Heidelberg, Germany | 353043 | |
50 mL tubes | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germany | 02-572-3001 | |
T175 cell culture flasks | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
0.22 µm filters | Merck, Darmstadt, Germany | SLGPM33RS |