マウスの脳、青斑核の局在
Summary
斑は、様々 な生理学的なプロセスに関わるニューロンの小さいクラスターです。ここでは、蛋白質やこの核で金属の研究のマウスの脳のセクションを準備するためのプロトコルについて述べる。
Abstract
軌跡青斑核 (LC) は、ノルエピネフリン生理機能の数を調節する神経細胞の生産の主要なハブです。液晶の構造的または機能的な異常皮質、海馬、小脳などいくつかの脳領域に影響を与えるし、うつ病、双極性障害、不安、パーキンソン病、アルツハイマー病に貢献するかもしれない。これらの疾患はしばしば金属 misbalance に関連付けられている、lc における金属の役割は部分的にしか理解されています。LC の形態と機能の研究は、人間の病態と金属の貢献を理解する必要です。マウスは、広く使用されている実験モデル、マウス液晶が小さい (~0.3 mm 径) と非専門家を特定するは難しい。ここでは、マウスの脳で LC をローカライズする段階的な免疫組織化学ベースのプロトコルについて述べる。ドパミン-β-水酸化酵素 (DBH)、およびまた、チロシンヒドロキシラーゼ (TH)、両方の酵素を液晶で高発現は、脳切片での免疫組織化学的マーカーとして使用されます。X 線蛍光顕微鏡 (XFM) による詳細な分析、組織形態学的研究、代謝性のテストと同様の金属のイメージングを含む LC を含むセクションに隣接するセクションを使用できます。
Introduction
軌跡青斑核 (LC) は、脳幹とノルエピネフリン (NE) 生産1の主要なサイトで重要な地域です。LC 脳2全体の予測を大脳皮質、海馬、小脳3に送信し、概日リズム4、5注意と記憶6を含む主要な生理的プロセスを調節します。7、認知過程8、および感情9,10を強調します。LC の機能不全は、神経疾患、精神神経疾患11を含むパーキンソン病12,13,14アルツハイマー病1415 うつ病に関与しています。 ,16,17, 双極性障害18,19, そして不安20,21,22,23,24します。 これらの役割を考えると、LC の分析はその機能と機能障害を勉強することが重要です。
マウスは、生理学的および病態生理学的プロセスの研究に広く使用されます。サイズが小さいためマウス LC は ~ 300 μ m、構造を見つける難しさにつながるの平均直径を有する。脳の断面、中に、LC は、コロナや矢状のセクションで簡単に逃したことが。動物で LC の同定を記述する利用可能な研究は、ステップバイ ステップのプロトコルを提供していない非専門家が1,25を従うことができます。したがって、LC のローカリゼーションのためのガイダンスを提供するいくつかのアプリケーション (図 1, , 図 2図 3) マウス脳のこの領域を検出する開発したプロトコルについて述べる。プロトコルは、胸高直径26,27, または日24、注意深く制御された脳区分および免疫組織化学的検出 LC28の高濃縮両方の酵素を適用されます。LC を免疫組織化学で見つかったら、隣接する脳スライスはさらなる研究、形態および代謝解析、x 線蛍光顕微鏡 (XFM)29を介して金属のイメージング研究などに使用できます。このプロトコル (図 3) の例として XFM について述べる。
Protocol
動物の研究は、ジョンズ ・ ホプキンス大学動物ケアと (ACUC) を使用するプロトコル番号 M017M385 によって承認されました。 1. 脳スライス 固定、3% イソフルランのアプリケーションでマウスを麻酔します。 イソフルランの滴でコットン ボールを浸すし、15 mL 遠心チューブ内に配置します。動物の鼻にチューブを置き、イソフルランを吸い込むことができます…
Representative Results
(Cu、Fe、Zn, Mn) など金属恒常性の変化は、神経学的疾患、LC34,35の変化などで多く観察されます。したがって、脳内金属のレベルを決定する疾患のメカニズムを理解するために必要です。記述のプロトコルを使用して生成された脳のセクションは、Cu と LC で他の金属のレベルを定量化し、LC 以外の地域のレベルにそれらを比?…
Discussion
このプロトコルの重要なステップは、供試体を正しく方向づけます。LC (小脳と下丘間の境界) を検索する脳の背側表面の解剖学的特徴を使用している我々 は、ためには、セクションが正しく位置合わせされることが重要です。マウス脳スライサー行列に脳を正しく設定に注意が必要です。核の欠落を回避する LC に前部と後部に 〜 500 μ m より多くの組織を切断をお勧めします。最も一般的な…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 はマウス コロニーの維持のための Abigael Muchenditsi を感謝します。アルゴンヌ国立研究所で高度な光子源の使用は、米国エネルギー省科学局オフィスの基本的なエネルギー科学、契約番号によって支えられた: デ AC02 06CH11357。ユーザー サポートや高度な光子源援助、オルガ Antipova と博士ステファン Vogt に感謝します。この作品は、SL に国立衛生研究所の助成金 2R01GM101502 で賄われていた。
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
References
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
- Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
- Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
- Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
- Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
- Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
- Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
- File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
- Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
- Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson’s disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
- Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson’s disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
- Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
- Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
- Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
- Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
- Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
- Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
- Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. 신경과학. 373, 7-19 (2018).
- Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
- McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
- Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
- Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
- Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
- Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
- Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
- Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
- Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
- Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
- Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
- Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson’s disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
- Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson’s disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, 565-574 (2016).
- James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).
Cite This Article
Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).