Локализация Локус пятно в мозг мыши
Summary
Локус пятно — небольшое скопление нейронов, участвующих в различных физиологических процессов. Здесь мы описываем протокол для подготовки разделов мозга мыши для исследования белков и металлов в этом ядре.
Abstract
Локус пятно (LC) является основным центром норадреналина, производства нейронов, которые модулируют ряд физиологических функций. Структурные или функциональные нарушения LC воздействие нескольких регионов мозга, включая кору, гиппокамп и мозжечке и может способствовать депрессии, биполярного расстройства, тревога, а также болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера. Эти заболевания часто связаны с металлическими дисбаланса, но лишь частично понимают роль металлов в LC. Морфологические и функциональные исследования LC необходимо лучше понять человека патологий и вклад металлов. Мышей являются широко используется Экспериментальная модель, но мыши LC небольшие (диаметром ~0.3 мм) и трудно определить для не эксперт. Здесь мы опишем шаг за шагом протокол на основе иммуногистохимия локализовать ЛК в мозг мыши. Допамин β-гидроксилазы (дуг) и в качестве альтернативы, тирозин гидроксилазы (TH), оба фермента, сильно выражена в ЛК, используются в качестве иммуногистохимических маркеров в срезах головного мозга. Участков, прилегающих к LC-содержащие разделы могут использоваться для дальнейшего анализа, включая гистологию для морфологических исследований, метаболических тестирования, а также металлических изображений рентгеновской микроскопии флуоресцирования (XFM).
Introduction
Локус пятно (LC) является важным регионом в ствол головного мозга и основных сайт производства норадреналина (NE)1. LC отправляет прогнозы во всем мозг2 коры, гиппокамп и мозжечке3 и регулирует основные физиологические процессы, включая Циркадный ритм4,5, внимания и памяти6, стресс,7,8когнитивные процессы и эмоции9,10. Дисфункция LC был вовлечен в неврологической и нервно-психических расстройств11, включая Паркинсона болезнь12,13,14, Альцгеймера болезнь14, депрессии15 ,16,17, биполярное расстройство18,19и тревоги20,21,,2223, 24. Учитывая эти роли, анализ LC имеет решающее значение для изучения ее функции и дисфункции.
Мышей широко используются для исследования процессов физиологического и патофизиологические. Из-за их малого размера мышь LC имеет средний диаметр ~ 300 мкм, привело к затруднению обнаружения структуры. При резании мозга, LC легко могут быть пропущены в коронковой или сагиттального секций. Имеющиеся исследования, описывающие Идентификация ЛК в животных не дают пошаговые протокол что non эксперт может следовать за1,25. Таким образом предложить руководство по локализации LC, мы описать протокол, который мы разработали, чтобы найти этот регион в мозг мыши для нескольких приложений (рис. 1, Рисунок 2, рис. 3). Протокол применяется тщательно контролируемых мозга секционирование и Иммуногистохимическое определение DBH26,27, или альтернативно й24, оба фермента высокообогащенного в LC28. После LC расположен по иммуногистохимия, фрагментов прилегающих мозга может использоваться для дальнейших исследований, в том числе Морфологические и метаболический анализ, а также металлических изображений исследования через рентгеновской флуоресценции микроскопии (XFM)29. Мы описываем XFM в качестве примера в настоящем Протоколе (рис. 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Правильной ориентации образца представляет собой решающий шаг в этом протоколе. Потому что мы используем анатомические особенности поверхности спинного мозга, чтобы найти LC (граница между мозжечка и уступает colliculus), важно, что в разделах быть выровнены правильно. Это требует ухода в пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Абигаэль Muchenditsi для поддержания колонии мыши. Использование передовых Фотон источника в Аргоннской национальной лаборатории была поддержана в Министерство энергетики США, управление науки, управление основные энергии наук, по контракту №: де-AC02-06CH11357. Мы благодарим Антипова Ольга и д-р Стефан Vogt для пользователей поддержки и помощи на источнике Advanced Фотон. Эта работа финансировалась национального института здравоохранения грант 2R01GM101502 в SL.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
References
- Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
- Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
- Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
- Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
- Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
- Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
- Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
- Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
- Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
- File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
- Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
- Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson’s disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
- Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson’s disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
- Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
- Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
- Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
- Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
- Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
- Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
- Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. 신경과학. 373, 7-19 (2018).
- Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
- McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
- Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
- Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
- Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
- Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
- Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
- Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
- Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
- Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
- Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
- Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson’s disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
- Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson’s disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, 565-574 (2016).
- James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).
