Nerve stamcelleforskningen differensiering av en ettrinns kaldt atmosfæriske Plasma behandling In Vitro

Summary

Denne protokollen mål å gi detaljerte eksperimentelle trinnene i en kald atmosfæriske plasma behandling på embryonale stamceller og immunofluorescence gjenkjenning for differensiering ekstrautstyr.

Abstract

Som utviklingen av fysiske plasma-teknologi, kaldt atmosfæriske plasmas (CAPs) har vært mye undersøkt i dekontaminering, kreftbehandling, sårheling, rotfylle, etc., danner et nytt forskningsfelt kalt plasma medisin. Å være en blanding av elektriske, kjemiske og biologiske reaktive arter, CAPs har vist sine evner til å forbedre nerve stamceller differensiering både i vitro og i vivo og er blitt en lovende måte nevrologisk sykdom behandling i fremtiden. Den mye mer spennende nyheten er at bruke CAPs kan innse ettrinns og trygt rettet, differensiering av nevrale stamceller (NSCs) for vev transport. Her viser vi detaljerte eksperimentelle protokollen bruker en Self-Made CAP jet enhet for å forbedre NSC differensiering i C17.2-NSCs og primære rotte nevrale stamceller, som observerer celle skjebnen av invertert og fluorescens mikroskopi. Med hjelp av immunofluorescence flekker teknologi, vi fant både NSCs viste en akselererende differensial hastighet enn gruppen ubehandlet, og ~ 75% av NSCs differensiert selektivt i neurons, som er hovedsakelig eldre, cholinergic og motor neurons.

Introduction

Rettet differensiering av NSCs i en bestemt avstamning for vev transport regnes som en av de mest lovende behandling for nevrodegenerative og neurotraumatic sykdommer¹. For eksempel er catecholaminergic dopaminergic neurons spesielt ønsket Parkinsons sykdom (PD) behandling. Men har tradisjonelle metoder for å forberede ønsket cellene transport mange ulemper, som kjemiske giftighet, skjemmende arr eller andre, som i stor grad hindrer programmene i NSCs i regenerativ medisin². Derfor er det svært nødvendig å finne en ny og sikker måte for NSC differensiering.

Plasma er den fjerde delstaten saker, følgende solid, væske og gass, og det utgjør mer enn 95% av saker i hele universet. Plasma er elektrisk nøytral med ubundet positive/negative og nøytrale partikler og genereres vanligvis av en høyspent utslipp i laboratoriet. I de siste to tiårene, har anvendelse av plasma i biomedisin fått stor oppmerksomhet over hele verden som utvikling av kaldt lufttrykk plasma-teknologi. Takket være denne teknikken, stabil lav temperatur plasma kan genereres i de omkringliggende luften på atmosfære uten bue dannelse og består av ulike reaktive arter, som reaktivt nitrogen arter (RNS), reaktive oksygen arter (ROS), ultrafiolett (UV) stråling, elektroner, ioner og elektriske feltet³. CAPs har unike fordeler for mikro-organisme inaktivering, kreft terapi, sårheling, behandling av hudsykdommer, celle spredning og celle differensiering^4,5,6,7. I tidligere arbeid viste vi at kaldt atmosfæriske plasma jet kan styrke differensiering av NSCs i både murine nevrale stamceller C17.2 (C17.2-NSCs) og primære rotte nevrale stamceller, viser et stort potensial til å bli et kraftig verktøy til regissert differensiering av NSCs⁸. Selv om mekanismen av CAP forbedring av NSC differensiering ikke er fullt ut forstått ennå, ingen generert av CAPs har vist seg for å være en nøkkelfaktor i prosessen. I dette arbeidet, som mål å tilby detaljert eksperimentelle protokollen bruker en atmosfærisk trykk helium/oksygen plasma jet for behandling av NSCs i vitro, celle forberedelse og forbehandling, morfologi observasjon av invertert mikroskop, og fluorescens mikroskopi observasjon av immunofluorescence flekker.

Protocol

1. celle kulturer og Predifferentiation Nevrale stamceller kultur og predifferentiation Forberede poly-D-lysin-belagt coverslips. Sette et sterilt dekkglassvæske (20 mm i diameter) i en 12-vel plate. Strøk dekket glasset med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vann (Tabell for materiale) for bedre celle vedheft på coverslips ved å følge de neste trinnene.Merk: Optimale forhold må bestemmes for hver celle linje og program. Tas aseptisk coat overflaten av dekkg…

Representative Results

Celle morfologi ble observert under invertert mikroskopet hver dag etter CAP behandling. Figur 2 viser vanlige invertert kontrast lys mikroskop bilder av celledifferensiering i begge linjer. Gruppen plasma-behandlet utstillinger en akselerert differensiering hastighet og en høy differensiering sammenlignet med gruppen kontroll og gass flyt. Immunofluorescent resultatene av C17.2-N…

Discussion

C17.2-NSCs er en type av udødeliggjort nevrale stamceller linje fra neonatal musen lillehjernen granulat laget celler, utviklet av Snyder og andre^10,11. C17.2-NSCs kan skille i nerveceller, astrocyttene og oligodendrocytes og er mye brukt i nevrovitenskap¹². I vår forrige undersøkelse, kan CAPs styrke differensiering av C17.2-NSCs i neurons. En bevis-av-prinsippet studie ble også gjennomført med primære rotte NSCs, og effekten av pla…

Materials

Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A