Summary

Differenziazione delle cellule staminali nervose di un One-Step Plasma atmosferico freddo trattamento In Vitro

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

Questo protocollo mira a fornire la procedura dettagliata sperimentale di un trattamento al plasma atmosferico freddo su cellule staminali neurali e rilevamento di immunofluorescenza per la valorizzazione di differenziazione.

Abstract

Come lo sviluppo della tecnologia di fisica del plasma, plasmi atmosferici freddi (CAPs) ampiamente sono stati studiati nella decontaminazione, trattamento del cancro, la guarigione della ferita, cura canalare, ecc., formando un nuovo campo di ricerca denominato medicina del plasma. Essendo una miscela di specie reattive elettriche, chimiche e biologiche, tappi hanno dimostrato le loro capacità per migliorare la differenziazione di cellule staminali nervose entrambi in vitro e in vivo e sono diventando una soluzione promettente per il trattamento di malattia neurologica in futuro. La notizia molto più eccitante è che utilizza capsule può realizzare uno stadio e diretto in modo sicuro, differenziazione delle cellule staminali neurali (NSC) per il trasporto del tessuto. Dimostriamo qui il dettagliato protocollo sperimentale di utilizzando un dispositivo di CAP jet self-made per migliorare la differenziazione NSC in C17.2-NSC e cellule staminali neurali del ratto primario, nonché osservando il destino della cellula da invertito e microscopia a fluorescenza. Con l’aiuto della tecnologia di colorazione di immunofluorescenza, abbiamo trovato entrambi la NSC ha mostrata un tasso accelerato di differenziale rispetto al gruppo non trattato, e ~ 75% del NSC differenziato selettivamente nei neuroni, che sono principalmente maturo, colinergici e motore neuroni.

Introduction

La differenziazione di NSC diretto verso una certa linea per il trasporto del tessuto è considerata una delle più promettenti terapie per malattie neurodegenerative e neurotraumatic1. Ad esempio, i neuroni dopaminergici catecholaminergic soprattutto sono desiderati nel trattamento del morbo di Parkinson (PD). Tuttavia, i metodi tradizionali per preparare le cellule desiderate per trasporto hanno molti inconvenienti, come ad esempio tossicità chimica, formazione della cicatrice o altri, che in gran parte ostacola le applicazioni delle CSN in medicina rigenerativa2. Di conseguenza, è molto necessario per trovare un romanzo e un modo sicuro per il differenziamento di NSC.

Il plasma è il quarto stato della materia, seguente solido, liquido e gas, e costituisce oltre il 95% della materia nell’intero universo. Il plasma è elettricamente neutro con unbound positivo/negativo e particelle neutre e viene solitamente generato da una scarica ad alta tensione in laboratorio. Negli ultimi due decenni, l’applicazione del plasma in biomedicina ha attirato grande attenzione in tutto il mondo come lo sviluppo della tecnologia del plasma freddo pressione atmosferica. Grazie a questa tecnica, stabile al plasma a bassa temperatura può essere generato nell’aria circostante atmosfera senza formazione di arco e si compone di varie specie reattive, come specie reattive dell’azoto (RNS), specie reattive dell’ossigeno (ROS), ultravioletto (UV) radiazione, gli elettroni, ioni e campo elettrico3. Tappi presentano i vantaggi unici per inattivazione di microrganismi, la terapia del cancro, cicatrizzazione, trattamento delle malattie della pelle, la proliferazione delle cellule e cellula differenziazione4,5,6,7. Nel precedente lavoro, abbiamo dimostrato che il getto di plasma atmosferico freddo può migliorare il differenziamento di NSC in murino delle cellule staminali neurali C17.2 (C17.2-NSC) e cellule staminali neurali del ratto primario, che esibisce un grande potenziale per diventare un potente strumento per la regia differenziazione di NSC8. Sebbene il meccanismo del potenziamento di CAP di differenziazione NSC completamente non è capito ancora, NO generato da tappi è stato dimostrato di essere un fattore chiave nel processo. In questo lavoro, ci proponiamo di fornire un dettagliato protocollo sperimentale di usando un getto plasma di elio/ossigeno di pressione atmosferica per il trattamento di NSC in vitro, preparazione delle cellule e pretrattamento, osservazione della morfologia di microscopio invertito, e osservazione di microscopia di fluorescenza di immunofluorescenza.

Protocol

1. culture e Predifferentiation delle cellule Predifferentiation e coltura delle cellule staminali neurali Preparare vetrini coprioggetti rivestiti con poli-D-lisina. Mettete un coprioggetto sterile (20 mm di diametro) in un piatto di 12-pozzetti. Ricoprire il vetro di copertura con poli-D-lisina, 0,1% p/v, in acqua (Tabella materiali) per migliorare l’aderenza delle cellule su lamelle seguendo i passi successivi.Nota: Le condizioni ottimale devono essere determi…

Representative Results

Morfologia delle cellule è stata osservata al microscopio invertito ogni giorno dopo il trattamento di CAP. La figura 2 Mostra le immagini del microscopio chiaro ordinario invertito in contrasto di fase della differenziazione delle cellule in entrambe le linee cellulari. Il gruppo trattato al plasma presenta un tasso di accelerazione del differenziamento e un rapporto di elevata differenziazione rispetto al gruppo di flusso di controllo e g…

Discussion

C17.2-NSC è una sorta di linea di cellule staminali neurali immortalata da cellule di strato granulare cerebellare di topo neonatale, sviluppata da Snyder e altri10,11. C17.2-NSC può differenziarsi in neuroni, astrociti e oligodendrociti e sono ampiamente usate in neuroscienze12. Nel nostro studio precedente, tappi potrebbero migliorare la differenziazione delle C17.2-CSN in neuroni. Uno studio di prova-de-principio è stato anche effett…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal programma di studioso di Huazhong, il fondo per l’innovazione indipendente of la Huazhong University of Science and Technology (n. 2018KFYYXJJ071) e National Natural Science Foundation of China (nn. 31501099 e 51707012).

Materials

Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

References

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Cite This Article
Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

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