Summary

בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול במבחנה

Published: January 11, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה שואפת לספק שלבים מפורטים ניסיוני של טיפול פלזמה אטמוספרי קר על תאי גזע עצביים וזיהוי immunofluorescence עבור שיפור בידול.

Abstract

כמו התפתחות הטכנולוגיה פלזמה הפיזי, פלזמות אטמוספרי קר (כמוסות) נחקרו באופן נרחב בטיהור, טיפול בסרטן, ריפוי פצעים, טיפול שורש, וכו ‘, יוצרים שדה מחקר חדש בשם פלזמה רפואה. להיות תערובת של מינים תגובתי חשמלית, כימית וביולוגית, כמוסות הראו את היכולות שלהם כדי לשפר עצב תאי גזע בידול בשני במבחנה והופך ויוו ואינם ניתנים דרך מבטיחה לטיפול מחלה נוירולוגית בעתיד. בחדשות הרבה יותר מרגשת היא באמצעות כמוסות עשויים להבין בשלב אחד, בבטחה ביים, התמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs) בשביל לרקמות תחבורה. נדגים כאן הפרוטוקול ניסיוני מפורט של שימוש בהתקן שווי מטוס מתוצרת עצמית לשיפור לבטחון לאומי בידול C17.2-NSCs, תאי גזע עצביים החולדה הראשית, וכן התבוננות גורל התא על ידי הפוכה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עם העזרה של immunofluorescence מכתים טכנולוגיה, מצאנו שני NSCs את הראה שיעור דיפרנציאלית מואצת יותר בקבוצה ללא טיפול, ~ 75% NSCs מובחן באופן סלקטיבי נוירונים, אשר הינם בעיקר בוגרים, שימוש, מנוע נוירונים.

Introduction

הבידול בבימויו של NSCs לתוך שושלת מסוימים לתחבורה רקמות נחשב של טיפולים המבטיחים ביותר עבור מחלות ניווניות, neurotraumatic1. לדוגמה, נוירונים דופאמין catecholaminergic הם בעיקר הרצוי לטיפול מחלת פרקינסון (PD). עם זאת, שיטות מסורתיות כדי להכין את התאים הרצויים עבור תחבורה יש חסרונות רבים, כגון כמות רעילה, היווצרות צלקת או אחרים, ומחבלים במידה רבה את היישומים של NSCs רפואה רגנרטיבית2. לכן, זה ממש הכרחי למצוא הרומן דרך בטוחה עבור בידול לבטחון לאומי.

פלזמה היא המדינה הרביעית של עניינים, הבאים מוצק, נוזל וגז, היא מהווה יותר מ 95% של נושאים בעולם כולו. פלזמה חשמלית ניטרליים עם חיובי/שלילי לא מאוגד וחלקיקים נייטרלי, מופק בדרך כלל על ידי הפרשות מתח גבוה במעבדה. בשני העשורים האחרונים, היישום של פלזמה ב וההתערבות משכה תשומת לב אדירה ברחבי העולם וכן פיתוח טכנולוגי פלזמה קר לחץ אטמוספירי. בזכות זה פירות טכני, יציב בטמפרטורה נמוכה פלזמה יכול להיווצר באוויר הסובב על האווירה מבלי במערך קשת ומורכבת ממינים שונים תגובתי, כגון חנקן ונבדקים מינים (האחיות המוסמכות), מינים חמצן תגובתי (ROS), אולטרה סגול (UV) קרינה, אלקטרונים, יונים ושדה חשמלי3. כמוסות יש יתרונות ייחודיים עבור מיקרו-אורגניזם איון, טיפול בסרטן, פצע מרפא, טיפול של מחלות עור, התפשטות תאים תאים בידול4,5,6,7. בעבודה הקודמת, הפגנו פלזמה אטמוספרי קר jet יכול לשפר את הבידול של NSCs תאי גזע עצביים מאתר C17.2 (C17.2-NSCs) והן תאי גזע עצביים החולדה הראשית, מפגין פוטנציאל גדול להפוך לכלי רב עוצמה בוים הבידול של NSCs8. למרות המנגנון של שיפור שווי של בידול לבטחון לאומי אינה מובנת במלואה, שנוצר על ידי אותיות לא הוכח להיות גורם מפתח בתהליך. בעבודה זו, אנו שואפים לספק פרוטוקול נסיוני מפורט של השימוש של פלזמה הליום/חמצן אטמוספרי סילון לטיפול NSCs במבחנה, הכנה תא, רעלני, מורפולוגיה תצפית על ידי מיקרוסקופ הפוכה, ו קרינה פלואורסצנטית התבוננות מיקרוסקופית של immunofluorescence מכתים.

Protocol

1. התא תרבויות Predifferentiation תאי גזע עצביים ותרבות predifferentiation להכין coverslips זכוכית אקרילית-D-ליזין-מצופה. לשים על coverslip סטרילי (20 מ מ קוטר) על פלטה 12-. טוב. מעיל הזכוכית המכסה עם פולי-D-ליזין, 0.1% w/v, במים (טבלה של חומרים) עבור אדהזיה תא טוב יותר על coverslips על-ידי ביצוע השלבים ה?…

Representative Results

מורפולוגיה תאים נצפתה תחת המיקרוסקופ הפוכה בכל יום לאחר הטיפול CAP. איור 2 מציג את הדימויים במיקרוסקופ אור רגיל ניגודיות שלב הפוכה הבידול תא בשתי השורות התא. הקבוצה שטופלו פלזמה תערוכות שיעור בידול מואצת, יחס התמיינות גבוהה לעומת הקבוצה זרימת גז ?…

Discussion

C17.2-NSCs הוא סוג של קו מונצחים תאי גזע עצביים מתאי שכבת פרטנית אסטרוציטומה העכבר neonatal, שפותחה על ידי שניידר ואחרים10,11. C17.2-NSCs יכולים להתמיין נוירונים, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים, נמצאים בשימוש נרחב במדעי המוח12. במחקר הקודם שלנו, כמוסות יכול לש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מלומד Huazhong, הקרן חדשנות עצמאית של אוניברסיטת Huazhong של המדע, הטכנולוגיה (מספר 2018KFYYXJJ071), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (‘ קט ‘ 31501099 ו- 51707012).

Materials

Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

References

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Play Video

Cite This Article
Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

View Video