Zenuw differentiatie van de stamcel door een One-step koude atmosferische Plasma behandeling In Vitro
Summary
Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde experimentele stappen van een koude atmosferische plasma behandeling op neurale stamcellen en immunofluorescentie detectie voor verhoging van de differentiatie.
Abstract
Als de ontwikkeling van fysieke plasmatechnologie, koude atmosferische plasma’s (CAPs) zijn grote schaal onderzocht in decontaminatie behandeling van kanker, wondgenezing, wortelkanaalbehandeling, enz., vorming van een nieuwe onderzoeksterrein plasma geneeskunde genoemd. Een mengsel van elektrische, chemische en biologische reactieve soorten, CAPs hebben vertoond hun capaciteiten om de zenuw stamcellen differentiatie beide in vitro en in vivo en zijn steeds een veelbelovende manier voor neurologische ziekte-behandeling in de toekomst. De veel spannender nieuws is dat met behulp van CAPs one-step kan realiseren, en veilig geregisseerd, differentiatie van neurale stamcellen (NSCs) voor het vervoer van het weefsel. Wij tonen hier de gedetailleerde experimenteel protocol van het gebruik van een zelf-gemaakte CAP jet-apparaat te verbeteren van NSC differentiatie in C17.2-NSCs en primaire rat neurale stamcellen, evenals observeren het lot van de cel door omgekeerde en fluorescentie microscopie. Met de hulp van immunofluorescentie kleuring van technologie, vonden we beide de NSCs toonde een versneld differentieel tarief dan de onbehandelde groep en ~ 75% van de NSCs selectief onderscheiden in neuronen, die voornamelijk volwassen, cholinerge en motor zijn neuronen.
Introduction
De gestuurde differentiatie van NSCs in een bepaalde bloedlijn voor weefsel vervoer wordt beschouwd als een van de meest beloftevolle therapieën voor neurodegeneratieve en neurotraumatic ziekten1. Catecholaminerge Dopaminerge neuronen zijn bijvoorbeeld vooral gewenst bij de behandeling van Parkinson (PD). Traditionele methoden voor te bereiden op de gewenste cellen vervoer hebben echter veel nadelen, zoals chemische toxiciteit, littekenvorming of anderen, die grotendeels belemmert de toepassingen van NSCs in de regeneratieve geneeskunde2. Het is daarom zeer noodzakelijk om het vinden van een roman en veilige manier voor NSC differentiatie.
Plasma is de vierde stand van zaken, volgende vaste stof, vloeistof en gas, en meer dan 95% van de zaken in het hele universum vormt. Plasma is elektrisch neutraal met niet-afhankelijke positieve/negatieve en neutrale deeltjes en wordt meestal gegenereerd door een hoog-voltage kwijting in het lab. In de laatste twee decennia, heeft de toepassing van plasma in biogeneeskunde enorme aandacht wereldwijd als de ontwikkeling van koude luchtdruk plasmatechnologie aangetrokken. Dankzij deze techniek, stabiele lage-temperatuur plasma kan worden gegenereerd in de omringende lucht in de atmosfeer zonder boog vorming en bestaat uit verschillende reactieve soorten, zoals reactieve stikstof soorten (RNS), reactieve zuurstof soorten (ROS), ultraviolet (UV) straling elektronen, ionen en elektrische veld3. CAPs hebben unieke voordelen voor inactivatie van micro-organisme, kankertherapie, wond genezing, behandeling van ziekten van de huid, celproliferatie en cel differentiatie4,5,6,7. In vorige werk, we laten zien dat koude atmosferische plasma jet kan het verbeteren van de differentiatie van NSCs in zowel de lymfkliertest neurale stamcellen C17.2 (C17.2-NSCs) en de primaire rat neurale stamcellen, vertonen een grote potentie om een krachtig instrument voor het gericht differentiatie van NSCs8. Hoewel het mechanisme van CAP versterking van NSC differentiatie niet volledig echter begrepen is geen gegenereerd door CAPs heeft bewezen een belangrijke factor in het proces. In dit werk, wij streven naar een gedetailleerde experimenteel protocol een atmosferische druk helium/zuurstof plasma straal te gebruiken voor de behandeling van NSCs in vitro, cel bereiding en voorbehandeling, morfologie observatie door omgekeerde Microscoop, en fluorescentie microscopie observatie van immunofluorescentie kleuring.
Protocol
Representative Results
Discussion
C17.2-NSCs is een soort van vereeuwigd neurale stamcellen lijn van neonatale muis cerebellaire granulaire laag cellen, ontwikkeld door Snyder en anderen10,11. C17.2-NSCs in de neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en kunnen onderscheiden en worden veel gebruikt in de neurowetenschappen12. In onze eerdere studie, kon CAPs de differentiatie van C17.2-NSCs in de neuronen verbeteren. Een bewijs-van-principe studie ook uitgevoerd met behulp va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Huazhong geleerde programma, het onafhankelijke innovatiefonds van de Huazhong Universiteit voor wetenschap en technologie (nr. 2018KFYYXJJ071) en de nationale Natural Science Foundation van China (nrs. 31501099 en 51707012).
Materials
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
