Mechanische Mikronisierung von Lipoaspirate für Regenerative Therapie

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Stromazellen vaskulären Bruchteil aus Fettgewebe durch eine Reihe von mechanischen Verfahren erhalten die Emulgierung und mehrere Centrifugations enthalten.

Abstract

Stromale vaskulären Bruch (SVF) ist eine regenerative Werkzeug für verschiedene Krankheiten geworden; Allerdings regelt die Gesetzgebung streng die klinische Anwendung der Zelle Produkte mit Kollagenase. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine injizierbare Mischung aus SVF Zellen und native extrazelluläre Matrix aus Fettgewebe durch ein rein mechanisches Verfahren zu generieren. Lipoaspirate werden in einer Zentrifuge und bei 1.200 X g für 3 min gesponnen. Die mittlere Schicht ist gesammelt und getrennt in zwei Schichten (High-Density Fett unten) und Low-Density Fett auf der Oberseite. Die obere Schicht wird direkt durch das intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X emulgiert. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz unter die Ölschicht gesammelt und definiert als die extrazelluläre Matrix (ECM) / SVF-Gel. Das Öl auf die oberste Schicht wird gesammelt. Ca. 5 mL Öl 15 mL von High-Density Fett hinzugefügt und emulgiert durch intersyringe verschieben, mit einer Rate von 20 mL/s für 6 X bis 8 X. Das emulgierte Fett wird bei 2.000 X g für 3 min zentrifugiert, und die klebrige Substanz ist auch ECM/SVF-Gel. Nach der Transplantation des ECM/SVF-Gels in nude Mäuse ist das Transplantat geerntet und von histologischen Untersuchung bewertet. Das Ergebnis zeigt, dass dieses Produkt das Potenzial hat, in normalen Fettgewebe zu regenerieren. Dieses Verfahren ist eine einfache, effektive mechanische Dissoziation Verfahren die SVF-Zellen eingebettet in ihre natürliche unterstützende ECM für regenerative Zwecke zu kondensieren.

Introduction

Stammzelltherapien bieten einen Paradigmenwechsel für Gewebereparatur und Regeneration, so dass sie eine alternative therapeutische Regime für verschiedene Krankheiten¹anbieten können. Stammzellen (z.B., induzierte pluripotente Stammzellen und embryonale Stammzellen) haben ein großes therapeutisches Potenzial sind aber beschränkt durch Zellregulation und ethische Erwägungen. Adipose abgeleitet mesenchymaler Stromazellen/Stammzellen (ASC) sind leicht zu beschaffen von Lipoaspirate und nicht den gleichen Beschränkungen; so ist es eine ideale Zelltyp für praktische regenerative Medizin²geworden. Darüber hinaus sie sind nonimmunogenic und haben reichlich vorhandenen Ressourcen aus körpereigenem Fett³.

ASC sind derzeit vor allem durch Kollagenase-vermittelten Verdauung des Fettgewebes gewonnen. Die stromale vaskuläre Bruchteil (SVF) von Fettgewebe enthält ASCs, endothelial Progenitor Cell, Perizyten und Immunzellen. Zwar erhalten eine hohe Dichte an SVF/ASC enzymatisch gezeigt wurde, um positive Auswirkungen haben, regelt die Gesetzgebung in verschiedenen Ländern streng die klinische Anwendung der Zell-basierte Produkte, die mit Hilfe von Kollagenase⁴. Verdauen das Fettgewebe mit Kollagenase für 30 min bis 1 h, SVF Zellen zu erhalten, erhöht das Risiko für beide exogene Material bei der Vorbereitung und biologische Kontamination. Die anhaftende Kultur und die Reinigung des ASC, die Tage bis Wochen dauert, erfordern spezielle Laborgeräte. Darüber hinaus werden in den meisten Studien SVF Zellen und ASC in der Schwebe verwendet. Ohne den Schutz der extrazellulären Matrix (ECM) oder einen anderen Träger freie Zellen sind anfällig, verursachen eine schlechte Zelle Aufbewahrung nach der Injektion und gefährden das therapeutische Ergebnis⁵. All diese Gründe beschränken die weitere Anwendung der Stammzell-Therapie.

Um ASC aus Fettgewebe ohne Kollagenase-vermittelten Verdauung zu erhalten, wurden verschiedene mechanische Bearbeitung-Verfahren, einschließlich der Zentrifugation, mechanische, hacken, Zerkleinern, pürieren und Zerkleinern, entwickelten^{6,7 , 8 , 9}. diese Methoden werden gedacht, um Gewebe und ASC kondensieren von mechanisch stören Reifen Adipozyten und ihre Öl-haltige Vesikel. Darüber hinaus zeigten diese Zubereitungen, die hohe Konzentrationen von ASC, therapeutische Potenzial als regenerativer Medizin in Tier^8,9,10Modelle.

Im Jahr 2013 eingeführt Tonnard Et Al. der Nanofat Technik, die beinhaltet, Herstellung von emulgierten Lipoaspirate durch Intersyringe Verarbeitung¹¹Pfropfen. Erstellt von Intersyringe, die Verlagerung Querkräfte kann selektiv Reifen Adipozyten brechen. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse entwickelten wir eine rein mechanische Bearbeitung-Methode, die entfernt die meisten Lipid und Flüssigkeit in den Lipoaspirate verlassen nur SVF Zellen und fraktionierte ECM, die ECM/SVF-Gel¹²ist. Hier beschreiben wir die Details des mechanischen Prozesses der menschlichen abgeleitet Fettgewebe, das ECM/SVF-Gel zu produzieren.

Protocol

Diese Forschung wurde von der ethischen Review Board im Nanfang Krankenhaus, Guangzhou, China genehmigt. Fettgewebe wurde gesammelt, von gesunden Spendern, gab schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie. Alle Tierversuche wurden durch die Nanfang Krankenhaus institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt und durchgeführt nach den Richtlinien des National Health and Medical Research Council (China). 1. ECM/SVF-Gel-Vorbereitung Ernten Sie Fett. Führen Sie …

Representative Results

Nach der Verarbeitung der Coleman Fett zu ECM/SVF-Gel, das Volumen der ausrangierten Öl nimmt 80 % des letzten Bandes, und nur 20 % des Fettgewebes unter die Ölschicht erhalten gilt als ECM/SVF-Gel (Abb. 1A). ECM/SVF-Gel hat eine glatte Flüssigkeit-wie Struktur, die es ermöglicht, durch eine feine Nadel 27 G gehen; jedoch Coleman Fett besteht aus einer integralen adipösen Aufbau mit großen Fasern und kann nur durch eine 18 G-Kanüle (<s…

Discussion

Stammzellbasierte regenerative Therapie hat einen großen potenziellen Nutzen bei verschiedenen Krankheiten gezeigt. ASC sind hervorragende therapeutische Kandidaten, denn sie einfach sind zu erhalten und haben die Kapazität für die Reparatur von Gewebe und die Regeneration der neuartige Gewebe¹⁵. Allerdings gibt es Einschränkungen für den Ausbau ihrer klinischen Anwendung, da es komplizierte Verfahren zum Isolieren von Zellen und Kollagenase erfordert für die Verarbeitung von<sup class="xref…

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus