Mekanisk Micronization af Lipoaspirates for regenerativ terapi

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at opnå stromale vaskulære brøkdel af fedtvæv gennem en serie af mekaniske processer, som omfatter emulgering og flere centrifugations.

Abstract

Stromale vaskulære brøkdel (SVF) er blevet en regenerativ værktøj for forskellige sygdomme; men regulerer lovgivningen strengt den kliniske anvendelse af celle produkter ved hjælp af collagenase. Vi præsenterer her, en protokol for at generere en injicerbar blanding af SVF celler og indfødte ekstracellulære matrix fra fedtvæv af en rent mekanisk proces. Lipoaspirates er sat i en centrifuge og spundet på 1.200 x g i 3 min. Det midterste lag er samlet og opdelt i to lag (high-density fedt nederst) og low-density fedt på toppen. Det øverste lag er direkte emulgeret med intersyringe flytte, med en hastighed på 20 mL/s til 6 x og 8 x. Emulgerede fedt centrifugeres ved 2.000 x g i 3 min, og den klæbende stof under olien lag er indsamlet og defineret som den ekstracellulære matrix (ECM) / SVF-gel. Olie på det øverste lag er indsamlet. Ca. 5 mL olie er føjet til 15 mL af high-density fedt og emulgeret med intersyringe flytte, med en hastighed på 20 mL/s til 6 x og 8 x. Emulgerede fedt centrifugeres ved 2.000 x g i 3 min, og en klæbrig substans er også ECM/SVF-gel. Efter transplantation af ECM/SVF-gel til nøgen mus er podekvisten høstet og vurderet ved histologisk undersøgelse. Resultatet viser, at dette produkt har potentiale til at regenerere i normal fedtvæv. Denne procedure er en enkel, effektiv mekanisk dissociation procedure at kondensere SVF celler integreret i deres naturlige støttende ECM til regenerativ formål.

Introduction

Stamcelleterapier giver et paradigmeskift for væv reparation og regeneration, så de kan tilbyde en alternativ terapeutiske regime for forskellige sygdomme¹. Stamceller (fx, inducerede pluripotente stamceller og embryonale stamceller) har store terapeutiske potentiale, men er begrænset på grund af celle regulering og etiske overvejelser. Fedt-afledt mesenchymale stromale/stamceller (ASCs) er let at opnå fra lipoaspirates og ikke underlagt de samme begrænsninger; Det er således blevet en ideel celletype for praktiske regenerativ medicin². Desuden, de er nonimmunogenic og har rigelige ressourcer fra autologt fedt³.

I øjeblikket er ASCs fremstillet primært ved collagenase-medieret nedbrydning af fedtvæv. De stromale vaskulære brøkdel (SVF) af fedtvæv indeholder ASCs, endotel stamfader celle, pericytes og immunceller. Selv om at opnå en høj tæthed af SVF/ASCs enzymatisk blev vist sig at have gavnlige virkninger, regulerer lovgivningen i flere lande nøje klinisk anvendelse af celle-baserede produkter ved hjælp af collagenase⁴. Fordøje fedtvæv med collagenase for 30 min til 1 time at få SVF celler øger risikoen for begge eksogene materiale i forberedelse og biologisk forurening. Den vedhængende kultur og rensning af ASCs, som tager dage til uger, kræver specifikke laboratorieudstyr. Desuden, i de fleste undersøgelser, SVF celler og ASCs bruges i suspension. Uden beskyttelse af ekstracellulære matrix (ECM) eller et andet flyselskab, gratis celler er sårbare, forårsage en dårlig celle opbevaring efter injektion og kompromittere terapeutiske resultatet⁵. Af alle disse grunde begrænser den videre anvendelse af stamcelleterapi.

For at opnå ASCs af fedtvæv uden collagenase-medieret fordøjelse, har flere mekaniske forarbejdningsprocesser, herunder centrifugering, mekanisk hakning, neddeling, purere og hakkes, været udviklet^{6,7 , 8 , 9}. disse metoder er troede at kondensere væv og ASCs af mekanisk forstyrre modne adipocytter og deres olie-holdige vesikler. Desuden, disse præparater, der indeholder høje koncentrationer af ASCs, viste betydelige terapeutiske potentiale som regenerativ medicin i animalske modeller^8,9,10.

I 2013 indført Tonnard et al. nanofat podning teknik, der involverer producerer emulgerede lipoaspirates af intersyringe behandling af¹¹. At klipning kraft skabt af intersyringe skiftende kan selektivt bryde modne adipocytter. Baseret på deres resultater, udviklet vi et rent mekanisk forarbejdningsmetode, der fjerner de fleste af lipid og væske i lipoaspirates, forlader kun SVF celler og fraktionerede ECM, som er ECM/SVF-gel¹². Heri, beskrive vi detaljerne i den mekaniske proces af menneske-afledte fedtvæv til at producere ECM/SVF-gel.

Protocol

Denne forskning blev godkendt af den etiske Review Board i Nanfang Hospital, Guangzhou, Kina. Fedtvæv er indsamlet fra raske donorer, der gav skriftligt informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen. Alle dyreforsøg blev godkendt af det Nanfang Hospital institutionelle Animal Care og brug udvalg og udført efter retningslinjerne for National sundhed og Medical Research Council (Kina). 1. ECM/SVF-gel forberedelse Høst fedt. Udføre Fedtsugning på et menneske med en 3…

Representative Results

Efter forarbejdning Coleman fedt til ECM/SVF-gel, mængden af kasserede olie fylder 80% af det endelige rumfang, og kun 20% af fedtvæv bevaret under olien lag betragtes som ECM/SVF-gel (fig. 1A). ECM/SVF-gel har en glat væske-lignende tekstur, der gør det muligt at gå gennem en 27 G fin nål; men Coleman fedt består af en integreret adipøst struktur med store fibre og kan kun gå gennem en 18 G kanyle (figur 1</stro…

Discussion

Stamcelle-baseret regenerativ terapi har vist en stor potentiel fordel i forskellige sygdomme. ASCs er udestående terapeutiske kandidater, fordi de er nemme at få og have kapacitet til væv reparation og regenerering af roman væv¹⁵. Der er dog begrænsninger til at udvide sin kliniske anvendelse, da det kræver komplicerede procedurer at isolere cellerne og collagenase til behandling af⁶. Det er således vigtigt at udvikle en enkel teknik for at få stamceller uden brug …

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus