Hier presenteren we een protocol om te verkrijgen stromale vasculaire breuk van adipeus weefsel door middel van een reeks van mechanische processen, waaronder membraanemulsificatie en meerdere centrifugations.
Stromale vasculaire breuk (SVF) is uitgegroeid tot een regeneratieve instrument voor verschillende ziekten; wetgeving regelt echter strikt de klinische toepassing van cel-producten met behulp van collagenase. Hier presenteren we een protocol voor het genereren van een injecteerbare mengsel van SVF cellen en inheemse extracellulaire matrix uit vetweefsel langs zuiver mechanische weg. Lipoaspirates zijn een centrifuge gestoken en gesponnen op 1.200 x g gedurende 3 minuten. De middenlaag wordt verzameld en gescheiden in twee lagen (hoge dichtheid onderaan) en lage dichtheid vet op de top. De bovenste laag is direct geëmulgeerd door intersyringe verschuift, met een snelheid van 20 mL/s voor 6 x tot 8 x. Het geëmulgeerd vet wordt gecentrifugeerd bij 2.000 x g gedurende 3 minuten, en de kleverige substantie onder de olie laag is verzameld en gedefinieerd als de extracellulaire matrix (ECM) / SVF-gel. De olie in de bovenste laag wordt verzameld. Ongeveer 5 mL olie is toegevoegd aan 15 mL high-density vet en geëmulgeerde door intersyringe verschuift, met een snelheid van 20 mL/s voor 6 x tot 8 x. Het geëmulgeerd vet wordt gecentrifugeerd bij 2.000 x g gedurende 3 minuten, en de kleverige substantie is ook ECM/SVF-gel. Na de transplantatie van de ECM/SVF-gel in naakt muizen, is de prothese geoogst en beoordeeld door histologische onderzoek. Het resultaat geeft aan dat dit product heeft het potentieel om te regenereren in normale adipeus weefsel. Deze procedure is een eenvoudige, effectieve mechanische dissociatie te condenseren van de cellen van de FØROYA ingebed in hun natuurlijke ondersteunende ECM voor regeneratieve doeleinden.
Stamcel-therapieën bieden een paradigmaverschuiving voor weefselherstel en regeneratie zodat zij een alternatieve therapeutische regime voor verschillende ziekten1 bieden kunnen. Stamcellen (b.v., geïnduceerde pluripotente stamcellen en embryonale stamcellen) hebben een groot therapeutisch potentieel maar zijn beperkt als gevolg van cel regelgeving en ethische overwegingen. Adipeus afkomstige mesenchymale stromale/stamcellen (ASC’s) zijn eenvoudig te verkrijgen van lipoaspirates en niet onderworpen aan dezelfde beperkingen; het is dus een ideale celtype voor praktische regeneratieve geneeskunde2geworden. Bovendien, ze zijn nonimmunogenic en hebben overvloedige hulpbronnen van autologe vet3.
ASC’s zijn op dit moment verkregen voornamelijk door collagenase-gemedieerde vertering van het vetweefsel. De stromale vasculaire breuk (SVF) van vetweefsel bevat ASC’s, Endotheel progenitor cel, pericytes en immuuncellen. Hoewel het verkrijgen van een hoge dichtheid van SVF/ASC’s enzymatisch bleek te hebben gunstige effecten, regelt de wetgeving in verschillende landen strikt de klinische toepassing van cel-gebaseerde producten met behulp van collagenase4. Het vetweefsel met collagenase voor 30 min tot 1 h te verkrijgen van SVF cellen verteren verhoogt het risico van zowel exogene materiaal bij de voorbereiding en de biologische verontreiniging. De aanhangend cultuur en de zuivering van ASC’s, die dagen tot weken duurt, vereisen specifieke laboratoriumapparatuur. Bovendien, in de meeste studies, SVF cellen en ASC’s worden gebruikt in suspensie. Zonder de bescherming van de extracellulaire matrix (ECM) of een andere vervoerder, vrije cellen zijn kwetsbaar, veroorzaken een slechte cel bewaren na injectie en compromis de therapeutische resultaat5. Al deze redenen beperken de verdere toepassing van stamcel therapie.
Voor het verkrijgen van ASC’s uit vetweefsel zonder collagenase-gemedieerde spijsvertering, verschillende mechanische processing procedures, met inbegrip van centrifugeren, mechanische hakken, versnipperen, pureren en hakken, geweest ontwikkelde6,7 , 8 , 9. deze methoden worden verondersteld te condenseren weefsel en ASC’s door mechanisch verstoren volwassen adipocytes en hun olie-bevattende blaasjes. Deze preparaten, hoge concentraties van ASC’s, toonde bovendien aanzienlijk therapeutisch potentieel als regeneratieve geneeskunde in dierlijke8,9,10 modellen.
In 2013 introduceerde Tonnard et al. de nanofat enten techniek, waarbij de overlegging van de geëmulgeerd lipoaspirates van intersyringe verwerking van11. De shearing kracht gemaakt door de intersyringe verschuiven kan selectief volwassen adipocytes breken. Op basis van hun bevindingen, ontwikkelde we een zuiver mechanisch verwerkingsmethode die verwijdert de meeste van de lipide en vloeistof in de lipoaspirates, verlaten alleen SVF cellen en gespreide ECM, oftewel ECM/SVF-gel12. Hierin beschrijven we de details van de mechanische proces van mens-afgeleide adipeus weefsel te produceren van de ECM/SVF-gel.
Stamcel-based regeneratieve therapie blijkt een grote potentiële voordelen in verschillende ziekten. ASC’s zijn uitstekende therapeutische kandidaten omdat ze gemakkelijk te verkrijgen en de capaciteit voor weefselherstel en de regeneratie van nieuwe weefsels15. Er zijn echter beperkingen aan het uitbreiden van de klinische toepassing ervan, omdat het vereist gecompliceerde procedures om cellen en collagenase voor de verwerking van6te isoleren. Het is dus essentieel voor h…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de National Nature Science Foundation uit China (81471881, 81601702, 81671931), de Stichting van de natuurwetenschappen van de provincie Guangdong (2014A030310155), en het beheerder Stichting van Nanfang ziekenhuis (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
DAPI | Thermofisher | D1306 | |
wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
nude nice | Southern Mdical University | / | |
light microscope | Olympus | / | |
50 mL tube | Cornig | 430828 | |
sterile bag | Laishi | / | |
microtome | Leica | CM1900 | |
centrifuge | Heraus |