Micronização mecânica de Lipoaspirates para terapia regenerativa

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter a fração vascular do estroma do tecido adiposo através de uma série de processos mecânicos, que incluem emulsificação e múltiplas centrifugações.

Abstract

Fração de vascular do estroma (SVF) tornou-se uma ferramenta regenerativa para várias doenças; no entanto, a legislação estritamente regula a aplicação clínica dos produtos de célula usando a colagenase. Aqui, apresentamos um protocolo para gerar uma mistura injectável de células SVF e nativo da matriz extracelular do tecido adiposo, por um processo puramente mecânico. Lipoaspirates são colocar em uma centrífuga e girou a 1.200 x g durante 3 min. A camada média é coletada e separada em duas camadas (alta densidade de gordura na parte inferior) e baixa densidade de gordura na parte superior. A camada superior é diretamente emulsionada deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa sob a camada de óleo é coletada e definida como a matriz extracelular (ECM) / SVF-gel. O óleo sobre a camada superior é coletado. Cerca de 5 mL de óleo é adicionado à 15 mL de gordura de alta densidade e emulsionado deslocando-se intersyringe, a uma taxa de 20 mL/s para 6 x 8 x. A gordura emulsionada é centrifugada a 2.000 x g durante 3 min, e a substância pegajosa é também ECM/SVF-gel. Após o transplante do ECM/SVF-gel em camundongos, o enxerto é colhido e avaliado através do exame histológico. O resultado mostra que este produto tem o potencial para se regenerar em tecido adiposo normal. Este procedimento é um procedimento de dissociação mecânica simples, eficaz para condensar as células SVF incorporadas em sua natural apoio ECM para fins regenerativos.

Introduction

Terapias de células-tronco fornecem uma mudança de paradigma para a regeneração e reparação tecidual para que eles possam oferecer um regime terapêutico alternativo para várias doenças¹. Células-tronco (por exemplo, as células-tronco pluripotentes induzidas e células-tronco embrionárias) têm um grande potencial terapêutico, mas são limitadas devido ao regulamento de célula e considerações éticas. Adiposo-derivados mesenquimais estromais/células-tronco (ASCs) são fáceis de obter do lipoaspirates e não sujeitos às mesmas restrições; assim, tornou-se um tipo de célula ideal para medicina regenerativa prática². Além disso, eles são nonimmunogenic e têm recursos abundantes de gordura autóloga³.

Atualmente, ASCs são obtidos principalmente por mediada por colagenase digestão do tecido adiposo. A fração vascular do estroma (SVF) do tecido adiposo contém células progenitoras endoteliais ASCs, pericitos e células do sistema imunológico. Embora a obtenção de uma elevada densidade de SVF/ASCs enzimaticamente foi mostrado para ter efeitos benéficos, a legislação em vários países estritamente regula a aplicação clínica dos produtos à base de célula usando colagenase⁴. Digerir o tecido adiposo com colagenase por 30 min a 1 h para obter as células SVF aumenta o risco de ambos material exógeno na preparação e contaminação biológica. A cultura aderente e a purificação de ASCs, que leva dias para semanas, exigem equipamentos laboratoriais específicos. Além disso, na maioria dos estudos, células SVF e ASCs são usados em suspensão. Sem a proteção da matriz extracelular (ECM) ou outra transportadora, células livres são vulneráveis, causar uma retenção de pobre célula após a injeção e comprometer o resultado terapêutico de⁵. Todas estas razões limitam a aplicação adicional de terapia com células tronco.

Para obter o ASCs do tecido adiposo sem digestão mediada por colagenase, vários procedimentos de processamento mecânico, incluindo a centrifugação, mecânica, picar, ralar, reduzir a puré e picagem, têm sido desenvolvidos^{6,7 , 8 , 9}. esses métodos são pensados para condensar o tecido e ASCs por perturbar mecanicamente adipócitos maduros e suas vesículas contendo óleo. Além disso, estas preparações, contendo altas concentrações de ASCs, mostraram considerável potencial terapêutico como medicina regenerativa em animal modelos^8,9,10.

Em 2013, et al . Tonnard introduziu o nanofat enxertia técnica, que envolve produzindo emulsionado lipoaspirates por intersyringe¹¹de processamento. A força de corte criada por intersyringe deslocando seletivamente pode quebrar adipócitos maduros. Baseado em seus findings, desenvolvemos um método de processamento puramente mecânico que remove a maioria dos lipídios e fluido no lipoaspirates, deixando apenas as células SVF e ECM fracionada, o que é ECM/SVF-gel¹². Aqui, descrevemos os detalhes do processo mecânico de humanos-derivadas de tecido adiposo para produzir o ECM/SVF-gel.

Protocol

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de revisão ética em Nanfang Hospital, Guangzhou, China. Tecido adiposo foi coletado de saudáveis doadores que deu consentimento informado por escrito para participar no estudo. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de uso e Nanfang Hospital institucional Cuidado Animal e executados de acordo com as diretrizes da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (China). 1. ECM/SVF-gel de preparação Gordura de colheita…

Representative Results

Depois de processar a gordura Coleman para ECM/SVF-gel, o volume de óleo descartado ocupa 80% do volume final, e apenas 20% do tecido adiposo, preservado sob a camada de óleo é considerado como ECM/SVF-gel (Figura 1A). ECM/SVF-gel tem uma textura suave do líquido, como que lhe permite passar por uma agulha fina de 27 G; no entanto, Coleman gordura é composta de uma estrutura integral adiposa com grandes fibras e só pode ir através de u…

Discussion

Terapia regenerativa baseada em células-tronco tem mostrado um grande benefício potencial em diferentes doenças. ASCs são excelentes candidatos terapêuticos porque eles são fáceis de obter e ter a capacidade de reparação tecidual e a regeneração de novos tecidos¹⁵. No entanto, existem limitações para expandir sua aplicação clínica, pois requer procedimentos complicados para isolar as células e colagenase para processamento⁶. Assim, é essencial desenvolver …

Materials

Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4	Molecular Probes	I21411
guinea pig anti-mouse perilipin	Progen	GP29
DAPI	Thermofisher	D1306
wide tip pipet	Celltreat	229211B
Confocal microscope	Leica	TCS SP2
nude nice	Southern Mdical University	/
light microscope	Olympus	/
50 mL tube	Cornig	430828
sterile bag	Laishi	/
microtome	Leica	CM1900
centrifuge	Heraus