Mekanisk Micronization av Lipoaspirates för regenerativ behandling
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla stromal vaskulär fraktion från adipose vävnad genom en serie av mekaniska processer, som inkluderar emulgering och flera centrifugations.
Abstract
Stromaceller vaskulär bråkdel (SVF) har blivit en regenerativ verktyg för olika sjukdomar. lagstiftningen reglerar dock strikt kliniska tillämpningen av cell produkter med kollagenas. Här presenterar vi ett protokoll för att generera en injicerbara blandning av SVF celler och native extracellulär matrix från adipose vävnad genom en rent mekanisk process. Lipoaspirates placeras i en centrifug och snurrade på 1,200 x g i 3 min. Det mellersta lagret samlas in och delas upp i två lager (högdensitets fett längst ned) och låg densitet fett på toppen. Det övre lagret är direkt emulgerade av intersyringe växling, med en hastighet av 20 mL/s för 6 x till 8 x. Emulgerade fettet centrifugeras vid 2000 x g i 3 min, och den klibbig substansen under olja lager samlas in och definieras som den extracellulär Matrixen (ECM) / SVF-gel. Oljan på det översta lagret samlas. Cirka 5 mL olja tillsätts 15 mL av högdensitets fett och emulgerade av intersyringe växling, med en hastighet av 20 mL/s för 6 x till 8 x. Emulgerade fettet centrifugeras vid 2000 x g i 3 min, och den klibbig substansen är också ECM/SVF-gel. Efter transplantationen av ECM/SVF-gelen i nakna möss, graften skördas och bedömas av histologisk undersökning. Resultatet visar att denna produkt har potential att regenerera till normal fettvävnad. Detta förfarande är en enkel, effektiv mekanisk dissociation procedur att kondensera SVF celler inbäddade i deras naturliga stödjande ECM för regenerativ ändamål.
Introduction
Stem cell terapier ger ett paradigmskifte för vävnad reparation och förnyelse så att de kan erbjuda en alternativ terapeutiska regimen för olika sjukdomar1. Stamceller (t.ex., inducerade pluripotenta stamceller och stamceller) har stor terapeutisk potential men är begränsad på grund av cell förordning och etiska överväganden. Adipose-derived mesenkymala stromaceller/stamceller (ASCs) är lätt att få från lipoaspirates och inte föremål för samma begränsningar; Således har det blivit en idealisk celltyp för praktisk regenerativ medicin2. Dessutom, de är nonimmunogenic och har rikliga resurser från autolog fett3.
För närvarande erhålls ASCs huvudsakligen genom kollagenas-medierad nedbrytning av fettvävnad. Stromaceller vaskulär fraktionen (SVF) av fettvävnad innehåller ASCs, endothelial progenitor cell, pericyter och immunceller. Även om att erhålla en hög täthet av SVF/ASCs enzymatiskt visade sig ha positiva effekter, reglerar lagstiftningen i flera länder strikt kliniska tillämpningen av cellbaserade produkter använder kollagenas4. Smälta fettvävnaden med kollagenas för 30 min till 1 h att få SVF celler ökar risken för både exogena material i förberedelse och biologisk förorening. Vidhäftande kulturen och rening av ASCs, som tar dagar till veckor, kräver viss laboratorieutrustning. Dessutom i de flesta studier används SVF celler och ASCs i suspension. Utan skyddet av extracellulär matrix (ECM) eller en annan transportör, gratis celler är sårbara, orsaka en dålig cell lagring efter injektion och äventyra den terapeutiska resultat5. Alla dessa skäl begränsa den fortsatta tillämpningen av stamcellsterapi.
För att erhålla ASCs från fettväv utan kollagenas-medierad matsmältningen, varit flera mekanisk bearbetning förfaranden, inklusive centrifugering, mekaniska hugga, fragmentering, mosning och malning, utvecklade6,7 , 8 , 9. dessa metoder är tänkt att kondensera vävnad och ASCs genom att mekaniskt störa mogen adipocyter och deras olja-innehållande vesikler. Dessutom visade dessa preparat, som innehåller höga koncentrationer av ASCs, stor terapeutisk potential som regenerativ medicin i djur modeller8,9,10.
I 2013 införde Tonnard et al. den nanofat ympning teknik, vilket innebär att producera emulgerade lipoaspirates genom intersyringe bearbetning11. Den klippning kraft som skapas av intersyringe skiftande kan selektivt bryta mogen adipocyter. Baserat på deras resultat, utvecklat vi en rent mekanisk bearbetningsmetod som avlägsnar de flesta lipid och vätska i lipoaspirates, lämnar bara SVF celler och fraktionerade ECM, som är ECM/SVF-gel12. Häri, beskriver vi Detaljer den mekaniska processen av människa fettvävnad att producera ECM/SVF-gelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stem cell-baserad regenerativ terapi har visat en stor potentiell fördel i olika sjukdomar. ASCs är utestående terapeutiska kandidater eftersom de är lätta att få och har kapacitet för vävnad reparera och regenerering av nya vävnader15. Dock finns det begränsningar att utöka dess kliniska tillämpning, eftersom det kräver komplicerade förfaranden för att isolera cellerna och kollagenas för bearbetning av6. Därför är det viktigt att utveckla en enkel teknik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av National natur Science Foundation Kina (81471881, 81601702, 81671931), Stiftelsen naturvetenskap i provinsen Guangdong i Kina (2014A030310155), och administratören Foundation av Nanfang sjukhuset (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).
Materials
| Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 | Molecular Probes | I21411 | |
| guinea pig anti-mouse perilipin | Progen | GP29 | |
| DAPI | Thermofisher | D1306 | |
| wide tip pipet | Celltreat | 229211B | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP2 | |
| nude nice | Southern Mdical University | / | |
| light microscope | Olympus | / | |
| 50 mL tube | Cornig | 430828 | |
| sterile bag | Laishi | / | |
| microtome | Leica | CM1900 | |
| centrifuge | Heraus |
References
- Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
- Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
- Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
- Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
- van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
- Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
- Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
- Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product – stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
- Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
- Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
- Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
- Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
- Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
- Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
- Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).
