一种用汽车 t 细胞进行的切杀检测
Summary
该方案旨在实时评估免疫治疗重定向 t 细胞 (car t 细胞) 对三维结构癌细胞 (球体) 的细胞毒性。
Abstract
免疫治疗已成为人们对抗癌斗争越来越感兴趣的领域, 否则是无法治疗的。在所有的免疫治疗方法中, 嵌合抗原受体 (car) 重定向 t 细胞获得了最壮观的结果, 特别是与儿科 b 急性淋巴细胞白血病 (b-all)。传统的 car t 细胞验证方法依赖于使用特异性和功能检测的 car t 细胞对目标细胞在悬浮和异种移植模型。不幸的是, 在体外进行的观测往往与在体内获得的结果脱钩, 通过增加另一个步骤, 可以避免大量的努力和动物的使用: 使用3d 培养。在将肿瘤细胞移植到动物模型中时, 从模仿肿瘤细胞三维结构的潜在靶细胞中产生球体是一种理想的选择。在这里, 我们报告了一种经济实惠、可靠和简单的方法, 从被转移的结直肠细胞系中生产球体, 作为采用细胞治疗的验证工具 (cd19 car t 细胞就是这里的例子)。该方法与先进的活体成像系统相结合, 可跟踪球体生长、效应细胞细胞毒性和肿瘤细胞凋亡。
Introduction
采用细胞转移 (act) 是下一代癌症治疗。它依赖于向患者注射效应细胞 (t-或 nk 细胞)。这些细胞可以用受体进行基因改造, 引导它们找到目标–肿瘤, 并摧毁它。最近, 当针对 b 细胞标记 cd19 的 chimeric 抗原受体 (car) 被引入患者 t 细胞以杀死他/她的癌症1时, 这种方法被证明是可行的。在 car 的情况下, 这是一个人工受体, 设计包括特定的抗体片段, 抗原结合域减少到一个实体指定的单链变量片段 (scfv), 链接到 t 细胞信令域。虽然有几种设计, 最常用的版本被称为第二代 car 设计, 包括 cd3z 的 tcr 信号和一个共同刺激域 (cd28, 4-1b, ox40 等)1,2. 当 cd19 car-t 细胞有效地治疗了许多 b 细胞恶性肿瘤患者 3,4时, 免疫治疗领域的大部分注意力都集中在了这种新的 act 形式上。在这一成功之后, 研究人员试图利用类似的设计, 将其他表位瞄准实体肿瘤, 但成效有限。不幸的是, 肿瘤特异性抗原的缺乏和更恶劣的肿瘤微环境使 car t 细胞对实体肿瘤的效果降低5。
目前, 最常用的体外验证策略依赖于二维 (2d) 系统, 这些系统只解决已经提到的实体肿瘤挑战的一个片段。传统上, 2d体外系统涉及 car t 细胞和目标癌细胞系的混合物作为单层, 以评估这些效应细胞的功能和特异性。虽然这些策略是研究的重要和重要部分, 但它们没有考虑到癌细胞的复杂形态和三维结构.在三维系统中培养的癌细胞, 称为球体, 通过基因表达谱7的变化获得新的表型特征, 这可能会影响定向效应细胞的识别。birgersdotter 和他的同事证明, 霍奇金淋巴瘤 (hl) 细胞系, 当只生长在三维培养模型中时, 获得的基因表达谱与原发肿瘤样本相似8。因此, 与标准的2d 系统相比, 球体或类似的3d 培养方法提供了更相关的体外模型。这类系统也类似于体内研究, 这些研究被视为特定 car 验证过程的最后一步。考虑到2d 系统无法模拟癌症簇的形态, 球体提供了类似的形态, 以评估 car t 细胞的功能之前, 体内模型。在一项研究中, pickl 等人确定, 人类表皮生长因子受体 (her2) 过度表达的球状模型显示出与体内模型9相似的信号特征。这进一步支持了球体提供了更相关和更接近体内的 car t 细胞评估。此外, car t 细胞对球体的验证可能有助于更严格地评估其有效性, 并防止一些设计过早转移到体内研究 10;因此, 通过牺牲较少的动物来促进伦理相关的研究。此外, 与经典的体内研究相比, 使用球体的协议并不比经典的 2d系统昂贵得多, 而且速度也更快。综合来看, 可以预测, 纳入球体研究将很快成为将体外研究和体内研究联系起来的标准做法。
在这里, 我们提出了从结肠癌细胞系 hct 116 的球体的制备。对该细胞系进行了修饰, 以表达人类 cd19 分子, 使其对 cd19 car t 细胞敏感, 并使用临床验证的 car 结构对杀灭事件进行明确评估。
Protocol
Representative Results
Discussion
在过去几年里, 使用球体作为验证未来癌症治疗的创新工具已成为一个越来越受关注的领域。球体是经典的二维体外分析和体内评估之间的中间步骤。该方法在肿瘤微环境模拟和基因分析方面对其效力有进一步的希望.本出版物中提出的协议从 saheen 等人11 改编为 inculyte s3, 是一种从结肠直肠细胞系生产三维肿瘤球体的经济实惠且简单的方法。将球体生成到…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了挪威研究理事会在赠款 #244388、#254817 和 #284983 项下的支持;挪威癌症协会 (#6829007);根据赠款 #17/00264-6 和 #2016006, 挪威健康地区东南部。
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
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