車 T 細胞スフェロイド殺害アッセイ
Summary
このプロトコルは、リアルタイムで 3 D 構造化癌細胞 (スフェロイド) に対する免疫療法のリダイレクトされた T 細胞 (T 細胞車) の細胞毒性を評価するために設計されています。
Abstract
免疫療法場合治療不可能な癌との闘いの関心の高まりのフィールドとなっています。免疫療法のすべてのメソッドの間では、キメラ抗原受容体 (車) は、B 急性リンパ性白血病小児 (B オール) で特に最も壮観な結果を得られた T 細胞をリダイレクトされます。車 T 細胞の古典的な検証方法は、特異性の利用と標的細胞懸濁液および異種移植モデルに対して車の T 細胞の機能アッセイに依存しています。残念ながら、体外の観察はしばしば生体内で得られた結果から分離され、多くの努力および動物は別のステップを追加することによって倹約できる: 3次元培養を使用。彼らは動物モデルにしみ込んでいるときに腫瘍細胞の 3次元構造を模倣する潜在的な標的細胞のスフェロイドの生産は、理想的な選択肢を表します。(ここでは CD19 車 T 細胞による例示) 養子細胞療法の検証ツールとして導入された大腸細胞ラインから回転楕円体を生成する、信頼性の高い手頃な価格と簡単な方法を報告する.このメソッドは、回転楕円体の成長が続くことができる高度のライブ イメージング システムと相まって、エフェクター細胞の細胞毒性および腫瘍細胞のアポトーシス。
Introduction
養子のセル転送 (ACT) は、次世代のがん治療法を表します。それはエフェクター細胞 (T または NK 細胞) の患者への注入に依存します。これらの細胞は、彼らの目標は、腫瘍にそれらを導くし、それを破壊する受容体と遺伝子組み換えできます。最近このアプローチは B 細胞のマーカー CD19 に対するキメラ抗原受容体 (CAR) は彼/彼女の癌の1を殺すために患者 T 細胞に導入されたときに可能であること示した。人工レセプターである車の場合デザインは特異抗体フラグメントの抗原結合ドメイン エンティティ指定された単一鎖可変フラグメント (scFv) に減少 T 細胞シグナル伝達ドメインにリンクされます。いくつかのデザインがありますが、最も一般的に使用されるバージョンは TCR シグナリングのための CD3z と共刺激の 1 つのドメインから成っている第二世代の車のデザインとして呼ばれます (CD28、4-1 bb, OX40 など)。1,2。 免疫療法フィールド CD19 車 T 細胞が B 細胞悪性腫瘍3,4多くの患者を効果的扱われたとき法律のこの新しいフォームへの注意のほとんどの監督。この成功に続いて研究者は限られた成功と固形腫瘍に対する他のエピトープをターゲットに似たようなデザインを悪用しようとします。残念ながら、腫瘍特異抗原とレンダリング車 T 厳しい腫瘍微小の希少性細胞腫瘍5に向けて以下の効果的なの。
現在、最も一般的に使用される生体外で検証の戦略は、すでに述べたように固形腫瘍の課題の一部にしか対応二次元 (2 D) システムに依存します。古典的な 2次元培養システムは、機能とこれらのエフェクター細胞の特異性を評価する分子として車 T 細胞とターゲット癌細胞の混合物を含みます。これらの戦略の研究の重要かつ不可欠な部分ですが、とることはありません考慮複雑な形態と癌細胞6三次元 (3 D) 構造。回転楕円体と呼ばれる 3 D のシステムで培養された細胞は、遺伝子発現プロファイルで7、リダイレクトされたエフェクター細胞による認識に影響を与える可能性があります変更を介して新しい形質を取得します。Birgersdotter と同僚は、3次元培養モデルでのみ栽培におけるホジキン リンパ腫 (HL) セルラインが原発腫瘍サンプル8のような遺伝子発現プロファイルを取得を例示します。したがって、回転楕円体または似たような 3 D 培養モデル標準的な 2 D システムとは対照的に関連性の高い方法論提供の文化.このようなシステムは、特定の車の検証プロセスの最後のステップとして見られている生体内での研究に似ています。がんのクラスターの形態を模倣する 2 D システムが失敗することを考えると、回転楕円体を提供する前に車の T 細胞の機能を評価するために同じような形成体内モデル。1 つの調査、Picklらは、ひと上皮成長因子受容体 (HER2) 癌細胞を過剰発現の回転楕円体モデルがインビボ モデル9に同様の信号プロファイルを示した識別。これはさらに回転楕円体が車の T 細胞の生体内評価をより関連性の近くでを提供することをサポートします。さらに、回転楕円体に対する T 細胞車検証がもっと批判的にその有効性を評価して、途中で生体内での研究への移動を防ぐデザインの一部を助けるかもしれない10;したがって、少ない動物を犠牲にして倫理的関係の研究に貢献します。また、回転楕円体を使用してプロトコルはより高価な古典的な 2 D システムよりも、はるかに高速古典的な生体内での研究と比較しています。一緒に取られて、1 つは、回転楕円体研究の包含の場合、in vitro および in vivo の研究をリンクする標準的な方法すぐになる予測できます。
大腸癌細胞株 HCT 116 から回転楕円体の作製を紹介します。この細胞株は、CD19 車 T 細胞に敏感なそれをレンダリングし、臨床的に検証された車の構造を使用して殺害の明確な評価を提供する人間の CD19 分子を表現に変更されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
将来のがんの治療法を検証する革新的なツールとして回転楕円体の使用年の関心の高まりのフィールドとなっています。回転楕円体は、古典的な 2 D の in vitro 解析および生体内の評価間の中間ステップを表しています。さらには、遺伝子発現プロファイル7だけでなく、腫瘍微小環境の模倣の面でその効力についての約束の多くを保持しています。この文書で示されるプロト…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品が助成金 #244388、#254817 と #284983; 下のノルウェーの研究評議会によって支えられました。ノルウェーの癌協会 (#6829007);ノルウェーの健康の補助金 #17/00264-6 と #2016006 の下で南東地域。
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
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