Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Summary

Dit protocol is ontworpen voor het beoordelen van de immunotherapeutische omgeleide T-cel (auto T-cel) cytotoxiciteit tegen 3D gestructureerde kankercellen (spheroïden) in real-time.

Abstract

Immunotherapie is uitgegroeid tot een gebied van de groeiende interesse in de strijd tegen kanker anders onbehandelbaar. Onder alle immunotherapeutische Doorverwezen chimeer antigeen receptor (auto) T-cellen verkregen van de meest spectaculaire resultaten, in het bijzonder met pediatrische B-acute lymfatische leukemie (B-ALL). Validatie van de klassieke methoden van auto T-cellen zijn, is afhankelijk van het gebruik van specificiteit en testen van de functionaliteit van de auto T cellen tegen doelcellen in suspensie en in xenograft-modellen. Helaas, opmerkingen in vitro zijn vaak losgekoppeld van de resultaten verkregen in vivo en veel inspanning en dieren kan worden gespaard door toe te voegen een andere stap: het gebruik van 3D-cultuur. De productie van spheroïden uit potentiële doelcellen die de 3D structuur van de tumorcellen na te bootsen wanneer ze worden geaccepteerd in de diermodel vertegenwoordigt een ideaal alternatief. Wij rapporteren hier een betaalbare, betrouwbare en gemakkelijke methode voor de productie van spheroïden van een getransduceerde colorectal cellijn als een hulpmiddel van de bevestiging voor adoptief celtherapie (hier wordt geïllustreerd door CD19 auto T-cellen). Deze methode is in combinatie met een geavanceerd levende imaging systeem dat sferoïde groei kan volgen, effector cellen apoptosis van cytotoxiciteit en tumor cel.

Introduction

Adoptief cel overdracht (ACT) vertegenwoordigt de volgende generatie kankerbehandeling. Zij beroept zich op de injectie van effector cellen (T – of NK-cellen) in een patiënt. Deze cellen kunnen genetisch worden gewijzigd met een receptor die hen leiden naar hun doel, de tumor, en vernietigen. Deze aanpak werd onlangs aangetoond dat het haalbaar wanneer een chimeer antigeen Receptor (auto) gericht tegen de markering van de B-cel CD19 werd geïntroduceerd in de patiënt T-cellen te doden zijn/haar kanker¹. In het geval van auto, die een kunstmatige receptor is, het ontwerp bestaat uit specifieke antilichaam fragmenten, het antigeen-bindend domein teruggebracht tot een entiteit aangewezen één keten variabele fragment (scFv), gekoppeld aan de signalering domeinen van T-cel. Hoewel er verschillende ontwerpen zijn, de meest gebruikte versies waarnaar wordt verwezen als tweede generatie auto ontwerpen, bestaan uit CD3z voor TCR signalering en een co-stimulatory domein (CD28, 4-1BB, OX40, enz.) ^{1 , 2}. het veld immunotherapie geregisseerd allermeest naar de aandacht voor deze nieuwe vorm van wet wanneer CD19 auto-T-cellen spenderen vele patiënten met B-cel maligniteiten^{3,4 behandelde}. Na dit succes, onderzoekers geprobeerd misbruik te maken van de vergelijkbare ontwerpen door gericht op andere epitopes voor solide tumoren met beperkt succes. Helaas, de schaarste van specifieke antigenen van de tumor en de hardere tumor microenvironments gesmolten auto T cellen minder doeltreffend naar solide tumoren⁵.

Op dit moment vertrouwen de meest gebruikte in vitro validatie strategieën op tweedimensionale (2D) systemen die alleen betrekking hebben op een fragment van de al genoemde solide tumor uitdagingen. Klassiek, waarbij 2D in vitro systemen een mengsel van auto T-cellen en cellijnen van doel kanker als monolayers de functionaliteit en de specificiteit van deze cellen effector te beoordelen. Hoewel deze strategieën belangrijk en essentieel onderdeel van de studies zijn, doen ze niet rekening houden met de complexe morfologie en driedimensionale (3D) structuur van de kanker cellen⁶. Kankercellen gekweekt in 3D systemen, aangeduid als spheroïden, verwerven nieuwe fenotypische kenmerken door veranderingen in gen expressie profiel⁷, die de erkenning door omgeleide effector cellen kunnen beïnvloeden. Birgersdotter en collega’s aangetoond dat een lijn van de cel van Hodgkin-lymfoom (HL), wanneer alleen gegroeid in een 3D cultuur model verwerft een genexpressie profiel dat is vergelijkbaar met primaire tumor monsters⁸. Daarom, spheroïden of soortgelijke 3D cultuur methodologieën aanbod relevanter in vitro modellen in tegenstelling tot standaard 2D systemen. Dergelijke systemen zijn ook vergelijkbaar met in vivo onderzoek die worden gezien als de laatste stap in het validatieproces voor een bepaalde auto. Gezien het feit dat 2D systemen niet na te bootsen de morfologie van kanker clusters, spheroïden bieden gelijkaardige formaties om te beoordelen van de functionaliteit van auto T cellen voorafgaand aan in vivo modellen. In een studie, Pickl et al. geïdentificeerd dat een sferoïde model van menselijke epidermale groeifactor receptor (HER2) overexpressing van kankercellen aangetoond vergelijkbare signalering profielen in vivo modellen⁹. Verder ondersteunt dit dat spheroïden meer relevante en close-te-in vivo beoordelingvan de auto T-cellen bieden. Bovendien, auto T-cel validatie tegen spheroïden zou kunnen helpen hun werkzaamheid meer kritisch te beoordelen en te voorkomen dat enkele van de ontwerpen verhuizen naar in vivo onderzoek voortijdig¹⁰; aldus, bij te dragen aan ethisch betrokken onderzoek door het offeren van minder dieren. Bovendien, protocollen met behulp van spheroïden zijn niet duurder dan de klassieke 2D systemen en veel sneller in vergelijking met de klassieke in vivo studies. Samen genomen, kan men voorspellen dat de opneming van sferoïde studies standaardpraktijk koppeling van in vitro en in vivo studies zal binnenkort.

Hier presenteren we de voorbereiding van de spheroïden van de dikke darm kanker cellijn HCT 116. Deze cellijn was aangepast zodat het menselijke CD19 molecuul te gevoelig voor CD19 auto T-cellen maken en te zorgen voor een duidelijke evaluatie van het doden met behulp van een klinisch gevalideerde auto construct express.

Protocol

1. generatie van spheroïden van Colorectal kanker cellijn Wassen HCT 116 (stabiel getransduceerde om uit te drukken Cluster van differentiatie 19 (CD19) en groene fluorescentie proteïne (GFP)) cel monolayers met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 5 mL of 10 mL voor een 75 cm2 kolf voor een 25 cm2 ). Voeg trypsine (0,5 mL voor een 25 cm2 of 1 mL voor een kolf van 75 cm2 ) en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Controleren van mobiele-det…

Representative Results

Zoals te zien in Figuur 1, is het van cruciaal belang om te controleren door stroom cytometry van het niveau van expressie van CD19 auto op T-cellen (figuur 1A) en het niveau van de CD19 op HCT116 tumor cellijnen (figuur 1B). Figuur 2 illustreert het resultaat van een typische sferoïde experiment. De geautomatiseerde beeldvormende apparatuur neemt foto’s in vier verschi…

Discussion

Het gebruik van spheroïden als een vernieuwend hulpmiddel voor het valideren van toekomstige kankerbehandeling is uitgegroeid tot een gebied van groeiende belangstelling in de afgelopen jaren. Spheroïden vertegenwoordigen een tussenstap tussen klassieke 2D analyse van in vitro en in vivo beoordeling. De methode verder houdt een heleboel belofte met betrekking tot hun potentie in termen van tumor nabootsen van de micro-omgeving en gene⁷profilering. Het protocol gepresenteerd in deze publicatie we…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience