Un essai de mise à mort de sphéroïde par les cellules de T de voiture

Summary

Ce protocole est conçu pour évaluer la cytotoxicité de lymphocytes (cellules T voiture) redirigée immunothérapeutique contre les cellules cancéreuses structurés (sphéroïdes) 3D en temps réel.

Abstract

L’immunothérapie est devenu un domaine d’intérêt croissant dans la lutte contre le cancer autrement impossibles à traiter. Parmi toutes les méthodes immunothérapeutiques, récepteur de l’antigène chimérique (voiture) redirigé NKT a obtenu les résultats plus spectaculaires, en particulier avec la pédiatrie B-la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-B). Les méthodes de validation classique de lymphocytes T de voiture reposent sur l’utilisation de la spécificité et les tests de fonctionnalité des cellules T de voiture contre les cellules cibles en suspension et dans des modèles de xénogreffes. Malheureusement, les observations faites in vitro sont souvent découplées de résultats obtenus in vivo et beaucoup d’effort et d’animaux puisse être épargné en ajoutant une autre étape : l’utilisation de la culture 3D. La production des sphéroïdes hors des cellules cibles potentielles qui imitent la structure 3D des cellules tumorales lorsqu’ils sont greffés dans le modèle animal représente une alternative idéale. Nous rapportons ici une méthode simple, abordable et fiable pour produire des sphéroïdes d’une lignée cellulaire de cancer colorectal transduite comme un outil de validation pour la thérapie cellulaire adoptive (exemplifié ici par les cellules CD19 voiture T). Cette méthode est couplée avec un système d’imagerie live avancé qui peut suivre la croissance de sphéroïde, cytotoxicité et tumeur de l’apoptose des cellules des cellules effectrices.

Introduction

Transfert de cellules adoptifs (ACT) représente le traitement du cancer la prochain génération. Il repose sur l’injection de cellules effectrices (ou NK-cellules T) dans un patient. Ces cellules peuvent être génétiquement modifiés avec un récepteur qui va les guider vers leur cible, la tumeur et le détruire. Récemment, cette approche s’est avérée possible lorsqu’un récepteur d’antigène chimérique (voiture) dirigé contre le marqueur de cellules B CD19 a été introduit dans les cellules du patient T pour tuer son cancer¹. Dans le cas de la voiture, qui est un récepteur artificiel, la conception se compose de fragments d’anticorps spécifiques, l’antigène binding domain réduit à un fragment de variable d’une chaîne unique désigné (scFv), entité liée à des domaines de signalisation de cellules T. Bien qu’il y a plusieurs dessins ou modèles, les versions les plus couramment utilisées dénommé comme deuxième génération modèles de voiture, se composent de CD3z pour la signalisation de TCR et un domaine de costimulation (CD28, 4-1BB, OX40, etc..) ^{1 , 2}. le domaine de l’immunothérapie réalisé la plupart de son attention à cette nouvelle forme de la loi lorsque les cellules CD19 voiture-T traitement efficacement de nombreux patients atteints de tumeurs malignes de lymphocytes B^3,4. Suite à ce succès, les chercheurs ont essayé d’exploiter les conceptions semblables en ciblant les autres épitopes pour des tumeurs solides avec un succès limité. Malheureusement, la rareté des antigènes spécifiques de la tumeur et les micro-environnements tumeur plus sévères rendus voiture T cellules moins efficaces vers des tumeurs solides⁵.

Actuellement, les stratégies de validation plus couramment utilisés in vitro reposent sur des systèmes bidimensionnels (2D) qui portent uniquement sur un fragment des défis déjà mentionné de tumeur solide. Classiquement, 2D en vitro systèmes comportent un mélange de cellules de T de voiture et de lignées de cellules cancéreuses cible comme monocouches pour évaluer la fonctionnalité et la spécificité de ces cellules effectrices. Bien que ces stratégies sont des parties importantes et vitales des études, ils ne prennent pas en considération la morphologie complexe et une structure de tridimensionnelle (3D) des cellules du cancer⁶. Cellules cancéreuses cultivées dans des systèmes 3D, dénommé sphéroïdes, acquièrent de nouveaux caractères phénotypiques à travers des changements dans le gène expression profil⁷, susceptibles d’influencer la reconnaissance par les cellules effectrices redirigée. Birgersdotter et ses collègues ont démontré qu’une lignée de cellules de Hodgkin lymphome (HL) lorsqu’il est cultivé seulement dans un modèle de culture 3D acquiert un profil d’expression génique qui est semblable à la tumeur primitive échantillons⁸. Par conséquent, sphéroïdes ou 3D similaires culture offre des méthodologies plus pertinent dans des modèles in vitro par opposition aux systèmes 2D standards. Ces systèmes sont également semblables à des études in vivo qui sont considérés comme la dernière étape dans le processus de validation d’une voiture donnée. Considérant que les systèmes 2D ne parviennent pas à imiter la morphologie des grappes de cancer, sphéroïdes proposent des formations similaires afin d’évaluer la fonctionnalité des cellules de T de voiture avant modèles in vivo. Dans une étude, Pickl Al identifié qu’un modèle de sphéroïde de récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) surexprimant les cellules cancéreuses démontré des profils similaires de signalisation de modèles in vivo⁹. Cela soutient encore que les sphéroïdes offrent plus pertinentes et fermer-à vivo évaluation des cellules T de la voiture. En outre, validation de lymphocytes-T de voiture contre sphéroïdes peut aider à évaluer leur efficacité plus critique et empêcher que certaines des conceptions études in vivo prématurément¹⁰; contribuant ainsi, à la recherche sur le plan éthique concerné en sacrifiant moins d’animaux. En outre, protocoles utilisant des sphéroïdes ne sont pas plus chers que les systèmes 2D classiques et beaucoup plus rapide par rapport aux études classiques en vivo . Globalement, on peut prédire que l’inclusion d’études de sphéroïde va bientôt devenir une pratique standard pour relier les études in vitro et in vivo.

Nous présentons ici la préparation des sphéroïdes de la lignée de cellules cancéreuses du côlon HCT 116. Cette lignée cellulaire a été modifiée afin d’exprimer la molécule CD19 humaine qui la rend sensible aux cellules T voiture CD19 et de fournir une évaluation claire de l’assassinat à l’aide d’une construction de voiture cliniquement validée.

Protocol

1. génération des sphéroïdes de lignée de cellules de Cancer Colorectal Monocouches de cellules laver HCT 116 (stablement transduites pour exprimer le Cluster de différenciation 19 (CD19) et protéine de Fluorescence verte (GFP)) avec phosphate buffered saline (PBS ; 5 mL pour un 25 cm2 ou 10 mL pour un flacon de2 75 cm). Ajouter la trypsine (0,5 mL pour un 25 cm2 ou 1 mL pour un flacon de2 75 cm) et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min. Vér…

Representative Results

Comme peut être vu dans la Figure 1, il est crucial de vérifier, par cytométrie en flux, le niveau d’expression du CD19 voiture sur les lymphocytes T (Figure 1 a) et le niveau de CD19 sur des lignées cellulaires tumorales HCT116 (Figure 1 b). La figure 2 illustre le résultat d’une expérience typique sphéroïde. Les appareils d’imagerie automatisée prend des…

Discussion

L’utilisation des sphéroïdes comme un outil innovant pour valider le traitement du cancer futur est devenu un domaine d’intérêt croissant au cours des années. Sphéroïdes représentent une étape intermédiaire entre le classique 2D analyse in vitro et in vivo évaluation. La méthode plus détient beaucoup de promesse concernant leur puissance en termes de tumeur micro-environnement imitant ainsi que du gène⁷de profilage. Le protocole présenté dans cette publication est une adaptatio…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience