कार टी कोशिकाओं द्वारा एक अंडाकार आकृति हत्या परख
Summary
इस प्रोटोकॉल को वास्तविक समय में 3 डी संरचित कैंसर कोशिकाओं (spheroids) के खिलाफ immunotherapeutic अनुप्रेषित टी सेल (कार टी-सेल) cytotoxicity का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है ।
Abstract
Immunotherapy कैंसर के खिलाफ लड़ाई में बढ़ती रुचि के एक क्षेत्र अंयथा अनुपचारित बन गया है । सभी immunotherapeutic तरीकों में, chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) टी कोशिकाओं को सबसे शानदार परिणाम प्राप्त, विशेष रूप से बाल चिकित्सा बी के साथ-एक्यूट लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (बी-सभी). कार टी कोशिकाओं के शास्त्रीय सत्यापन तरीकों निलंबन में और xenograft मॉडल में लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं की विशिष्टता और कार्यक्षमता की परख के उपयोग पर भरोसा करते हैं । दुर्भाग्य से, इन विट्रो में किए गए टिप्पणियों अक्सर vivo में प्राप्त परिणामों से जोड़े जाते हैं और प्रयास और जानवरों के एक बहुत कुछ एक और कदम जोड़कर बख्शा जा सकता है: 3 डी संस्कृति का उपयोग. संभावित लक्ष्य कोशिकाओं के बाहर spheroids का उत्पादन है कि ट्यूमर कोशिकाओं के 3 डी संरचना नकल जब वे पशु मॉडल में engrafted रहे है एक आदर्श विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है । यहां, हम अपनाने सेल थेरेपी के लिए एक मांयता उपकरण के रूप में एक transduced कोलोरेक्टल सेल लाइन से spheroids का उत्पादन करने के लिए एक किफायती, विश्वसनीय और आसान तरीका रिपोर्ट (CD19 कार टी कोशिकाओं द्वारा यहां उदाहरण) । इस विधि एक उंनत लाइव इमेजिंग प्रणाली है कि अंडाकार आकृति विकास, प्रभाव कोशिकाओं cytotoxicity और ट्यूमर सेल apoptosis का पालन कर सकते है के साथ युग्मित है ।
Introduction
दत्तक कोशिका अंतरण (अधिनियम) अगली पीढ़ी के कैंसर के उपचार का प्रतिनिधित्व करता है । यह एक रोगी में प्रभाव कोशिकाओं (टी या NK-कोशिकाओं) के इंजेक्शन पर निर्भर करता है । इन कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से एक रिसेप्टर कि उनके लक्ष्य, ट्यूमर के लिए मार्गदर्शन करेंगे के साथ संशोधित किया जा सकता है, और इसे नष्ट कर । हाल ही में इस दृष्टिकोण को व्यवहार्य होना दिखाया गया है जब एक Chimeric प्रतिजन रिसेप्टर (कार) बी के खिलाफ निर्देश सेल मार्कर CD19 रोगी टी कोशिकाओं में शुरू किया गया था उसके कैंसर1को मारने के लिए । कार, जो एक कृत्रिम रिसेप्टर है के मामले में, डिजाइन विशिष्ट एंटीबॉडी टुकड़े होते हैं, प्रतिजन बाइंडिंग डोमेन एक श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv), टी-सेल संकेतन डोमेन से जुड़े नामित इकाई को कम । हालांकि वहां कई डिजाइन, सबसे अधिक इस्तेमाल किया संस्करणों दूसरी पीढ़ी के कार डिजाइन के रूप में संदर्भित कर रहे हैं, TCR संकेतन और एक सह stimulatory डोमेन (CD28, 4-1BB, OX40, आदि के लिए CD3z से मिलकर बनता है) 1 , 2. immunotherapy क्षेत्र के अधिनियम के इस नए रूप में जब CD19 कार टी कोशिकाओं बी सेल द्रोह3,4के साथ कई रोगियों का इलाज किया efficaciously अपने ध्यान के सबसे निर्देशित । इस सफलता के बाद शोधकर्ताओं ने सीमित सफलता के साथ ठोस ट्यूमर के लिए अन्य epitopes को लक्षित करते हुए इसी तरह के डिजाइनों का दोहन करने की कोशिश की. दुर्भाग्य से, ट्यूमर विशिष्ट एंटीजन की कमी और कठोर ट्यूमर microenvironments प्रदान की कार टी कोशिकाओं ठोस ट्यूमर की दिशा में कम प्रभावी5.
वर्तमान में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया इन विट्रो सत्यापन रणनीतियों पर दो आयामी (2d) सिस्टम है कि केवल पहले से ही उल्लेख किया ठोस ट्यूमर चुनौतियों का एक टुकड़ा पता निर्भर करते हैं । शास्त्रीय रूप से, 2 डी इन विट्रो प्रणालियों में कार टी कोशिकाओं और लक्ष्य कैंसर सेल लाइनों का एक मिश्रण monolayers के रूप में कार्यक्षमता और इन प्रभाव कोशिकाओं की विशिष्टता का आकलन करने के लिए शामिल है । हालांकि इन रणनीतियों महत्वपूर्ण और अध्ययन के महत्वपूर्ण भागों रहे हैं, वे ध्यान में जटिल आकृति विज्ञान और तीन आयामी (3 डी) कैंसर कोशिकाओं6की संरचना नहीं लेते हैं । कैंसर की कोशिकाओं 3d प्रणालियों में, spheroids के रूप में कहा जाता है, जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल7में परिवर्तन के माध्यम से नए phenotypic लक्षण प्राप्त है, जो redirected प्रभाव कोशिकाओं द्वारा मांयता को प्रभावित हो सकता है । Birgersdotter और सहकर्मियों का प्रदर्शन किया है कि एक Hodgkin लिंफोमा (एचएल) सेल लाइन जब केवल एक 3d संस्कृति मॉडल में हो एक जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल है कि प्राथमिक ट्यूमर8नमूनों के समान है प्राप्त । इसलिए, spheroids या समान 3d संस्कृति के तरीके में और अधिक प्रासंगिक की पेशकश इन विट्रो मॉडल के रूप में मानक 2d सिस्टम का विरोध किया । ऐसे सिस्टम वीवो स्टडीज में भी समान हैं जो किसी दी हुई कार की मान् यता प्रक्रिया में अंतिम चरण के रूप में देखे जाते हैं । कि 2d सिस्टम को ध्यान में रखते हुए कैंसर समूहों की आकृति विज्ञान की नकल करने में विफल, spheroids इसी तरह संरचनाओं की पेशकश करने के लिए कार टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता का आकलन करने से पहले vivo मॉडल में । एक अध्ययन में, Pickl एट अल. की पहचान की है कि मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (HER2) के एक अंडाकार आकृति मॉडल कैंसर कोशिकाओं को व्यक्त करने vivo मॉडल9में समान संकेतन प्रोफाइल का प्रदर्शन किया । यह आगे का समर्थन करता है कि spheroids प्रस्ताव और अधिक प्रासंगिक और बंद करने के लिए vivo कार टी कोशिकाओं का आकलन । इसके अतिरिक्त, spheroids के विरुद्ध कार टी-सेल सत्यापन उनकी प्रभावकारिता का अधिक गंभीर आकलन करने में मदद कर सकता है और कुछ डिजाइनों को पहले से ही10से अधिक vivo अध्ययनों में ले जाने से रोकता है; इस प्रकार, कम पशुओं का त्याग करके नैतिक रूप से संबंधित अनुसंधान में योगदान । इसके अलावा, spheroids का उपयोग प्रोटोकॉल शास्त्रीय 2d सिस्टम से अधिक महंगा नहीं कर रहे है और बहुत तेजी के रूप में vivo अध्ययन में शास्त्रीय की तुलना में । एक साथ लिया, एक भविष्यवाणी कर सकते है कि अंडाकार आकृति अध्ययन का समावेश जल्द ही मानक अभ्यास बन जाएगा करने के लिए इन विट्रो में और vivo अध्ययन में लिंक ।
यहां, हम बृहदांत्र कैंसर सेल लाइन HCT ११६ से spheroids की तैयारी वर्तमान । यह सेल लाइन मानव CD19 अणु व्यक्त करने के लिए यह CD19 कार टी कोशिकाओं के प्रति संवेदनशील और एक चिकित्सकीय सत्यापित कार के निर्माण का उपयोग कर हत्या का स्पष्ट आकलन प्रदान करने के लिए संशोधित किया गया था ।
Protocol
Representative Results
Discussion
भविष्य के कैंसर के इलाज को मान्य करने के लिए एक अभिनव उपकरण के रूप में spheroids का उपयोग पिछले वर्षों में बढ़ती रुचि का एक क्षेत्र बन गया है । Spheroids में शास्त्रीय 2d के बीच एक मध्यवर्ती कदम का प्रतिनिधित्व करते ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम नार्वे अनुसंधान परिषद द्वारा अनुदान के तहत समर्थन किया गया था #244388, #254817 और #284983; नार्वे कैंसर सोसायटी (#6829007); नार्वे स्वास्थ्य क्षेत्र दक्षिण पूर्व के तहत अनुदान #17/00264-6 और #2016006 ।
Materials
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
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