Questo protocollo è progettato per valutare la citotossicità T-cellula (auto T-cellula) reindirizzata immunoterapia contro le cellule cancerose strutturate 3D (sferoidi) in tempo reale.
L’immunoterapia è diventata un campo di crescente interesse nella lotta contro il cancro altrimenti intrattabile. Tra tutti i metodi immunotherapeutic, recettore chimerico antigene (auto) Reindirizzamento cellule T ottenute i risultati più spettacolari, in particolare con la leucemia linfoblastica acuta B pediatrica (B-ALL). Metodi di convalida classica delle cellule di T auto si basano sull’uso di specificità e test di funzionalità delle cellule T auto contro le cellule bersaglio in sospensione e in modelli di xenotrapianto. Purtroppo, le osservazioni fatte in vitro spesso sono disaccoppiate dai risultati ottenuti in vivo e un sacco di fatica e animali potrebbe essere risparmiato con l’aggiunta di un altro passo: l’uso della cultura 3D. La produzione di sferoidi fuori potenziali cellule bersaglio che imitano la struttura 3D delle cellule del tumore, quando essi sono innestate nel modello animale rappresenta l’alternativa ideale. Qui, segnaliamo un metodo conveniente, affidabile e facile da produrre sferoidi da una linea cellulare colorettale trasdotte come uno strumento di convalida per la terapia cellulare adottiva (esemplificato qui dalle cellule di T auto CD19). Questo metodo è accoppiato con un avanzato sistema di imaging dal vivo che possa seguire la crescita della sferoide, effettrici cellule apoptosi delle cellule del tumore e citotossicità.
Trasferimento adottivo di cellule (ACT) rappresenta il trattamento di cancro di generazione successivo. Essa si basa sull’iniezione di cellule effettrici (T – o cellule NK) in un paziente. Queste cellule possono essere geneticamente modificate con un recettore che li guiderà alla loro destinazione, il tumore e distruggerlo. Recentemente questo approccio è stato indicato per essere fattibile quando un recettore chimerico antigene (auto) diretto contro il marcatore di cellule B CD19 è stato introdotto nelle cellule del paziente T per uccidere il suo cancro1. Nel caso di auto, che è un recettore artificiale, il disegno consiste di frammenti anticorpali specifici, l’antigene vincolante dominio ridotto a un frammento di variabile entità designata a singola catena (scFv), legata ai domini di segnalazione del T-cell. Anche se ci sono parecchi disegni, le versioni più comunemente usate di cui come seconda generazione auto disegni, costituito da CD3z per la segnalazione di TCR e un dominio di costimolazione (CD28, 4-1BB, OX40, ecc.) 1 , 2. il campo di immunoterapia diretto la maggior parte della sua attenzione a questa nuova forma di atto quando CD19 auto-T cellule trattate efficacemente numerosi pazienti con le malignità delle cellule di B3,4. Dopo questo successo, i ricercatori hanno cercarono di sfruttare i disegni simili prendendo di mira altri epitopi per tumori solidi con successo limitato. Purtroppo, la scarsità di antigeni specifici del tumore e le più severe microambienti di tumore resi auto T cellule meno efficace nei confronti di tumori solidi5.
Attualmente, le strategie di convalida più comunemente usato in vitro si basano su sistemi bidimensionali (2D) che interessano solo un frammento delle sfide già citato tumore solido. Classicamente, 2D in vitro sistemi coinvolgono una miscela delle cellule T auto e linee cellulari del cancro di destinazione come strati monomolecolari per valutare la funzionalità e la specificità di queste cellule effettrici. Anche se queste strategie sono parti importanti e vitali degli studi, non prendono in considerazione la complessa morfologia e struttura tridimensionale (3D) del cancro cellule6. Le cellule tumorali coltivate in sistemi 3D, definito come sferoidi, acquisiscono nuovi tratti fenotipici attraverso cambiamenti nel gene espressione profilo7, che possa influenzare il riconoscimento di cellule effettrici reindirizzata. Birgersdotter e colleghi hanno dimostrato che una linea cellulare di linfoma (HL) Hodgkin quando coltivata solo in un modello 3D cultura acquisisce un profilo di espressione genica che è simile al tumore primario campioni8. Di conseguenza, sferoidi o 3D simile cultura offerta di metodologie più pertinenti in modelli in vitro al contrario di sistemi 2D standard. Tali sistemi sono anche simili a studi in vivo, che sono visti come il passo finale nel processo di convalida di una determinata macchina. Considerando che i sistemi 2D non riescono a imitare la morfologia dei cluster di cancro, sferoidi offrono formazioni simili per valutare la funzionalità delle cellule di T auto prima di modelli in vivo. In uno studio, Pickl et al. identificato che un modello di sferoide del recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER2) che overexpressing le cellule tumorali hanno dimostrato profili simili segnalazione a modelli in vivo9. Questo ulteriore sostiene che sferoidi offrono più pertinenti e close-in vivo valutazione delle cellule di T di auto. Inoltre, convalida di auto T-cellula contro sferoidi potrebbe aiutare valutare la loro efficacia più criticamente e impedire alcuni dei disegni di trasferirsi in vivo gli studi prematuramente10; contribuendo in tal modo, alla ricerca eticamente interessato sacrificando meno animali. Inoltre, protocolli utilizzando sferoidi non sono più costosi rispetto ai classici sistemi 2D e molto più veloce rispetto alla classica in vivo studi. Presi insieme, si può prevedere che l’inclusione degli studi sferoide diventerà presto la pratica standard per collegare gli studi in vitro e in vivo.
Qui, presentiamo la preparazione di sferoidi dalla linea cellulare del cancro del colon HCT 116. Questa linea cellulare è stata modificata per esprimere la molecola CD19 umana rendono sensibile ai linfociti CD19 auto e fornire una chiara valutazione dell’uccisione mediante un costrutto auto clinicamente validato.
L’uso di sferoidi come strumento innovativo per convalidare il trattamento del cancro futuro è diventato un campo di crescente interesse negli ultimi anni. Sferoidi rappresentano un passaggio intermedio tra il classico 2D analisi in vitro e valutazione in vivo. Il metodo ulteriormente tiene un sacco di promesse per quanto riguarda la loro potenza in termini di che imita il micro-ambiente del tumore così come gene profiling7. Il protocollo presentato in questa pubblicazione è stato adattato da s…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal Norwegian Research Council sotto sovvenzioni #244388, #254817 e #284983; l’associazione del cancro norvegese (n. 6829007); Il norvegese salute regione sud-est sotto Grant n. 17/00264-6 e #2016006.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | – |
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
15 ml tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | – |
Incucyte S3 | Essen Bioscience |