Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Summary

Este protocolo destina-se a avaliar a citotoxicidade de células T (células T carro) imunoterapia redirecionada contra células cancerosas estruturadas 3D (esferoides) em tempo real.

Abstract

Imunoterapia tornou-se um campo de crescente interesse na luta contra o câncer caso contrário intratável. Entre todos os métodos de imunoterapia, receptor de antígeno Quimérico (carro) Redirecionado células T obtidas os resultados mais espetaculares, em particular com leucemia linfoblástica aguda-B Pediátrica (B-ALL). Métodos de validação clássica de células T do carro dependem o uso de especificidade e de ensaios de funcionalidade das células T de carro contra células alvo em suspensão e em modelos de enxerto. Infelizmente, as observações feitas in vitro são muitas vezes dissociadas do resultados obtidos na vivo e um monte de esforço e animais poderia ser poupado, adicionando mais um passo: o uso da cultura 3D. A produção de esferoides de potencial nas células-alvo que imitam a estrutura 3D das células do tumor, quando eles são incorporados no modelo animal representa uma alternativa ideal. Aqui, nós relatamos um método acessível, confiável e fácil de produzir esferoides de uma linha celular colorretal transduzidas como uma ferramenta de validação para a terapia celular adotiva (exemplificada aqui por pilhas de T de carro CD19). Este método é acoplado com um avançado sistema de geração de imagens ao vivo que pode acompanhar o crescimento de esferoide, efetoras células citotoxicidade e tumor apoptosis da pilha.

Introduction

Transferência de células adotivos (ACT) representa o tratamento de câncer na próxima geração. Ele conta com a injeção de células efetoras (células T ou NK) em um paciente. Estas células podem ser geneticamente modificadas com um receptor que irá guiá-los até seu alvo, o tumor e destruí-lo. Recentemente, esta abordagem foi mostrada para ser viável quando um Receptor de antígeno Quimérico (carro) dirigido contra o marcador de célula B CD19 foi introduzido nas células do paciente T matar seu câncer¹. No caso do carro, que é um receptor artificial, o projeto consiste em fragmentos de anticorpos específicos, o antigénio vinculativa domínio reduzido a um fragmento de variável entidade designada de cadeia única (scFv), ligada aos domínios de sinalização de células T. Embora haja vários designs, as versões mais comumente usadas referidos como segunda geração desenhos dos carros, consistem de CD3z para sinalização de TCR e um domínio co-estimulatória (CD28, 4-1BB, OX40, etc.) ^{1 , 2}. o campo da imunoterapia dirigido a maioria de sua atenção para esta nova forma do acto quando células CD19 carro-T eficazmente trataram numerosos pacientes com neoplasias malignas de células B^3,4. Após este sucesso, os pesquisadores tentaram explorar os projetos similares ao direcionamento outros resumos para tumores sólidos com sucesso limitado. Infelizmente, a escassez de antígenos específicos do tumor e o microambiente que tumor mais duras processado carro T células menos eficaz para tumores sólidos⁵.

Atualmente, as estratégias mais comumente usados em vitro validação dependem bidimensionais (2D) sistemas que abordam apenas um fragmento dos desafios já mencionado tumor sólido. Classicamente, 2D em vitro sistemas envolvem uma mistura de células T de carro e linhas de células de câncer de alvo como monocamadas para avaliar a funcionalidade e a especificidade dessas células efetoras. Embora estas estratégias são peças importantes e vitais dos estudos, eles não levam em consideração a morfologia complexa e os estrutura tridimensional (3D) do câncer células⁶. As células cancerosas, cultivadas em sistemas 3D, conhecido como esferoides, adquirem novas características fenotípicas através de alterações no gene expressão perfil⁷, que possam influenciar o reconhecimento pelas células efetoras redirecionada. Birgersdotter e colegas demonstraram que uma linhagem de células Hodgkin Linfoma (HL) quando só cresceu em um modelo 3D da cultura adquire um perfil de expressão do gene que é semelhante ao tumor primário amostras⁸. Portanto, esferoides ou 3D semelhante cultura oferta de metodologias mais relevante em modelos de vitro em oposição aos sistemas 2D padrão. Tais sistemas são também semelhantes aos estudos in vivo, que são vistos como a etapa final no processo de validação de um determinado carro. Considerando que os sistemas 2D não imitar a morfologia de clusters de câncer, esferoides oferecem formações similares para avaliar a funcionalidade das células T de carro antes de modelos in vivo. Em um estudo, Pickl et al identificaram que um modelo de esferoide do receptor do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) superexpressão células cancerosas demonstrado perfis de sinalização semelhantes a modelos in vivo⁹. Isto suporta mais que esferoides oferecem mais relevantes e close-para-na avaliação de vivo das células T de carro. Além disso, validação de células T carro contra esferoides pode ajudar a avaliar sua eficácia mais criticamente e impedir que alguns dos projetos movendo-se prematuramente para estudos in vivo¹⁰; contribuindo assim, para pesquisas eticamente preocupada sacrificando menos animais. Além disso, protocolos utilizando esferoides não são mais caros do que os sistemas 2D clássicos e muito mais rápido em comparação com estudos clássicos na vivo . Tomados em conjunto, pode-se prever que a inclusão de estudos esferoide em breve se tornará uma prática padrão para vincular estudos in vitro e in vivo.

Aqui, apresentamos a preparação de esferoides da linhagem de células de câncer de cólon HCT 116. Esta linha de celular foi modificada para expressar a molécula CD19 humana para torná-lo sensível às células CD19 carro T e para fornecer uma avaliação clara da matança usando uma construção de carro clinicamente validada.

Protocol

1. geração de esferoides de linhagem de células de câncer colorretal Monocamadas de células lavar HCT 116 (estàvel transfectadas para expressar o Cluster de diferenciação 19 (CD19) e proteína de fluorescência verde (GFP)) com fosfato tampão salino (PBS; 5 mL por uma de 25 cm2 ou 10 mL para um balão de2 de 75 cm). Adicionar a tripsina (0,5 mL por uma de 25 cm2 ou 1 mL para um balão de2 de 75 cm) e incube as células a 37 ° C por 5 min. Verificar…

Representative Results

Como pode ser visto na Figura 1, é fundamental verificar por citometria de fluxo, o nível de expressão de CD19 carro em células T (figura 1A) e o nível de CD19 em linhas de células de tumor HCT116 (figura 1B). A Figura 2 exemplifica o resultado de um experimento típico esferoide. Automatizada de imagem aparelho tira fotos em quatro diferentes canais: campo claro, …

Discussion

O uso de esferoides como uma ferramenta inovadora para validar o tratamento do câncer futuro tornou-se um campo de interesse crescente nos últimos anos. Esferoides representam uma etapa intermediária entre o clássico 2D análise in vitro e in vivo-avaliação. O método ainda detém muita promessa em relação a sua potência em termos de tumor micro-ambiente imitando assim como gene de perfil⁷. O protocolo apresentado nesta publicação foi adaptado de Saheen et al.^…

Materials

Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Number: RNBG7037
75 cm² growth area flasks	VWR	430639	Lot Number: 2218002
75 cm² growth area flasks	VWR	734-2705	Lot Number: 3718006
Trypsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Number: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 ml	Life Technology (Gibco)	21875-091	Lot Number: 1926384
Fetal Bovine Serum	Gibco	10500064	Lot Number: 08Q3066K
Gentamicin	Thermo Fischer	15750060	Lot Number: 1904924A
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fischer	15250061	Lot Number: 1886513
96 well plate, round bottom	VWR	734-1797	Lot Number: 33117036
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Thermo Fischer	11132D	–
X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L	BioNordika	BE02-060Q	Lot Number: 8MB036
CTS Immune Cell Serum Replacement	Thermo Fischer	A2596102	Lot Number: 1939319
IL-2 Proleukin	Novartis		Lot Number: 505938M
IncuCyte Annexin V Red Reagent	Essen Bioscience	4641	Lot Number: 17A1025-122117
Reagent Reservoir	VWR	89094-672	Lot Number: 89094-672
15 ml tubes	VWR	734-1867	Lot Number: 19317044
anti-human CD19-PE	BD Biosciences	555413	Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch	115-066-072	Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583
Streptavidin-PE	BD Biosciences	554061	Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328
HCT 116 Colorectal Carcinoma Line	ATCC	CCL-247	–
Incucyte S3	Essen Bioscience