اثنين-فوتون تصوير الجذب Microglial العمليات تجاه ATP أو السيروتونين في الدماغ الحادة شرائح
Summary
Microglia، الخلايا المناعية المقيمين من الدماغ، والاستجابة بسرعة مع التغيرات المورفولوجية لإدخال تعديلات على بيئتهم. هذا البروتوكول توضح كيفية استخدام اثنين-فوتون الفحص المجهري لدراسة جاذبية عمليات microglial تجاه السيروتونين أو ATP في الدماغ الحادة شرائح من الفئران.
Abstract
خلايا Microglial هي الخلايا المناعية الفطرية المقيم في الدماغ باستمرار مسح البيئة الخاصة بهم مع عملياتها طويلة، وعند اختلال التوازن، الخضوع للتغيرات المورفولوجية. على سبيل المثال، يدفع آفة ليزر في بضع دقائق إلى نمو موجه من عمليات ميكروجليال، وتسمى أيضا “اتجاهي الحركة”، تجاه الموقع للإصابة. يمكن الحصول على تأثير مماثل بإيصال محلياً ATP أو السيروتونين (5-هيدروكسيتريبتاميني [5-HT]). في هذه المقالة، نحن تصف وضع بروتوكول للحث على نمو اتجاهات العمليات microglial تجاه تطبيق محلي ATP أو 5-HT في شرائح الدماغ الحادة للفئران الصغار والكبار وصورة هذا الجذب على مر الزمن بالفحص المجهري مولتيفوتون. طريقة بسيطة للقياس الكمي بصورة حرة ومفتوحة المصدر برمجيات التحليل المقترح. هو تحدي الذي لا يزال يميز شرائح الدماغ الحادة الوقت المحدود، تتناقص مع التقدم في العمر، خلالها الخلايا تظل في حالة فيزيولوجية. هذا البروتوكول، وبالتالي، يسلط الضوء على بعض التحسينات التقنية (الدائرة المتوسطة، الهواء السائل واجهة، التصوير الدائرة مع نضح مزدوجة) تهدف إلى تحسين جدوى خلايا microglial على مدى ساعات عدة، لا سيما في الشرائح من الفئران الكبار.
Introduction
خلايا Microglial الضامة المقيم في الدماغ وتلعب دوراً في كل الظروف الفسيولوجية والمرضية1،2. لديهم مورفولوجيا الغاية تشعبت ويتم باستمرار توسيع والتراجع عن العمليات3،4. ويعتقد هذا السلوك “المسح” أن تكون ذات صلة وضرورية لدراسة البيئة المحيطة بهم. يتم التعبير عن اللدونة المورفولوجية ل microglia في ثلاث طرق. أولاً، أن بعض المركبات تعدل سرعة مورفولوجيا microglial: إضافة ATP5،6 أو5،نمدا7 في الأجلين المتوسط والاستحمام شرائح المخ الحاد يزيد من تعقيد تشعبات ميكروجليال، وفي حين يقلل من إفراز6. هذه الآثار أما مباشرة توسط مستقبلات ميكروجليال (ل ATP وإفراز) أو المطالبة بإطلاق سراح ATP من الخلايا العصبية (نمدا). ثانيا، بسرعة النمو وتراجع عمليات ميكروجليال، تسمى حركية أو “المراقبة”، يمكن أن تتأثر بعوامل خارج الخلية8أو9،اختلالات التوازن10الطفرات9، 10،11. وثالثاً، بالإضافة إلى هذه التغييرات الخواص مورفولوجيا وحركية، microglia لديها القدرة على توسيع عملياتها توجه نحو ماصة إيصال ATP3،5،12، 13 , 14، في الثقافة، في شرائح الدماغ الحادة أو في الحية، أو تسليم 5-HT في الدماغ الحادة شرائح15. ووصفت هذا النمو الموجه لعمليات ميكروجليال، وتسمى أيضا حركية اتجاهي، أولاً كاستجابة لليزر محلي آفة3،4. وهكذا، الفيزيولوجية، يجوز أن تتعلق بالاستجابة للإصابة أو اللازمة لاستهداف العمليات microglial تجاه الاشتباكات العصبية أو مناطق الدماغ التي تحتاج إلى التقليم خلال التنمية15،16، أو فيالفسيولوجية 17 ،،من1819 أو الحالات المرضية9،،من1819،20 في مرحلة البلوغ. ثلاثة أنواع من التغييرات الشكلية التي تعتمد على مختلف الآليات داخل الخلايا11،،من1320، ومجمع معين واحد ليس بالضرورة تعدل كل منهم (مثل نمدا، الذي يعمل بشكل غير مباشر على microglia، له تأثير على مورفولوجيا ولكن عدم حمل حركية اتجاهي5،7). ولذلك، عندما تهدف لوصف تأثير مركب أو طفرة أو علم أمراض على microglia، من المهم أن تميز المكونات الثلاثة لما اللدونة المورفولوجية. وهنا يصف لنا أسلوباً لدراسة اتجاهات نمو عمليات microglial تجاه مصدر محلي للمجمع، و، هنا، ATP أو 5-HT.
وهناك عدة نماذج لدراسة الجذب microglia العمليات: الثقافات الأولية في بيئة 3D6،،من1819، الدماغ الحادة شرائح6،،من1315، وفي فيفو التصوير3،13. المجراة في النهج الذي هو الأفضل للحفاظ على الحالة الفسيولوجية ل microglia. بيد أن التصوير إينترافيتال من المناطق العميقة يتطلب إجراءات جراحية معقدة، وذلك، أنها غالباً ما تقتصر على الطبقات القشرية السطحية. استخدام الثقافة الأولية microglia هو أسلوب أسهل لاختبار عدد كبير من الشروط مع عدد محدود من الحيوانات. ومع ذلك، فإنه من المستحيل الحصول على مورفولوجية الخلية نفسها كما هو الحال في فيفو، والخلايا تفقد تلك التفاعلات الفسيولوجية مع الخلايا العصبية و astrocytes. شرائح الدماغ الحادة تمثل حلاً وسطا بين هذين النهجين. هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة هياكل الدماغ التي خلاف الصعب للوصول إلى وصورة بدقة عالية في الحية، والتحقيق في شرائح من مراحل الأطفال حديثي الولادة، بينما transcranial مجهرية تتم غالباً في مرحلة البلوغ. وأخيراً، فإنه يجعل من الممكن لمراقبة في الوقت الحقيقي آثار التطبيق المحلي للمخدرات، وتكرار التجارب أثناء استخدام عدد محدود من الحيوانات. ومع ذلك، هو مسألة مع شرائح الدماغ الحادة ضيق الوقت (بضع ساعات) خلالها الخلايا البقاء على قيد الحياة، خاصة بالنسبة لشرائح من الفئران التي مضى عليها أكثر من أسبوعين، واحتمال تغير مورفولوجيا microglia على مر الوقت21،22 .
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإعداد شرائح الدماغ الحادة من Cx3cr1 الصغار والكبارالتجارة والنقل/+ الفئران تصل إلى شهرين من العمر، مع الحفاظ على مورفولوجيا microglia وحركية لعدة ساعات. ثم، ونحن تصف كيفية استخدام هذه الشرائح لدراسة جاذبية عمليات microglial تجاه المركبات مثل ATP، أو 5-HT.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالمحافظة على، على خلاف في فصلها أو شريحة أورجانوتيبيك الثقافة، سلامة هيكلية مع تعديلات شبكة محدودة، شرائح الدماغ الحادة السماح للباحثين بدراسة ميكروجليا في بيئتهم الفسيولوجية. ومع ذلك، أحد القيود الرئيسية التي هي حقيقة أن ينشئ إجراء تشريح على الإصابات التي يمكن أن تنال من سرعة صلاحية ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الخلايا والأنسجة مرفق التصوير من معهد دو Fer à مولان، حيث تم إجراء جميع الحصول على الصور وتحليل. تم دعم هذا العمل جزئيا خلال المركز الوطني “البحث العلمي”، المعهد الوطني الصحة et de la “ميديكال البحوث”، “العلوم في جامعة السوربون”، ومن المنح المقدمة من جامعة السوربون جامعتا بيير et (جامعة ماري كوري برنامج اميرجينسيوبمك 2011/2014)، والمؤسسة من أجل البحوث la sur le الدماغ، فرنسا مؤسسة، المؤسسة من أجل البحوث ميديكال “ايكيب FRM DEQ2014039529″، الوزارة الفرنسية للبحوث (الوكالة الوطنية للبحوث ANR-17-CE16-0008 ودعفينير يشرف برنامج “بيو-Psy لابيكس” ANR-11-معرض أيدكس-0004-02) و “البحوث التعاونية” في برنامج “علم الأعصاب الحسابية”، المؤسسة الفرنسية “العلم الوطني والوكاله الوطنية” للبحوث (رقم: 1515686). جميع المؤلفين وينتسب إلى البحوث المجموعات التي هي أعضاء في مدرسة باريس لعلم الأعصاب (سياسة الجوار الأوروبية) ومن “لابيكس” بيو-Psy. هو طالب دكتوراه والمنتسب إلى جامعة السوربون، دكتوراه في كوليج، F-75005 باريس، فرنسا، وتموله “لابيكس” بيو-Psy. وعين زميل ما بعد دكتوراه تمول “البحوث التعاونية” في برنامج “علم الأعصاب الحسابية”، المؤسسة الفرنسية “العلم الوطني والوكاله الوطنية” للبحوث (رقم: 1515686). يشكر المؤلفون كولودجيساك مارتا الذين شاركوا في البدء في المشروع.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), 231-239 (1999).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
