Mikroglial süreçleri cazibe ATP veya Serotonin akut beyin dilimleri içinde doğru iki fotonlu görüntüleme
Summary
Microglia, yerleşik bağışıklık hücreleri beynin, çabuk morfolojik değişiklikler ile çevrenin değişiklikler cevap. Bu protokol iki fotonlu mikroskobu serotonin veya ATP doğru mikroglial süreçlerinde fareler dilim akut beyin cazibe çalışmak için nasıl kullanılacağını açıklar.
Abstract
Sürekli onların çevre onların uzun süreçleri ile inceden inceye gözden geçirmek ve homeostasis kesintiye uğraması, hızlı morfolojik değişiklikleri meydana ikamet doğuştan gelen bağışıklık hücreleri beynin mikroglial hücrelerdir. Örneğin, bir lazer lezyon birkaç dakika içinde bir odaklı büyüme yaralanma site doğru “yön hareketliliği” olarak da adlandırılır mikroglial süreçlerin neden olmaktadır. ATP veya serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]) yerel olarak sunarak benzer bir etki elde edilebilir. Bu makalede, biz mikroglial işlemlerin ATP veya 5-HT genç ve yetişkin mice akut beyin dilim içinde yerel bir uygulama doğru bir yön büyümesini teşvik ve zaman içinde bu cazibe tarafından multiphoton mikroskopi olabilir görüntü için bir iletişim kuralı tanımlamak. Miktar ücretsiz ve açık kaynak görüntü analiz yazılımı ile basit bir yöntem önerdi. Hala akut beyin dilimleri karakterize bir meydan okuma ile yaş sırasında hücreleri fizyolojik bir durumda kalır, azalan sınırlı zamanı. Bu iletişim kuralı, böylece, mikroglial hücre canlılığı başta dilimleri yetişkin fareler üzerinden birkaç saat içinde en iyi duruma getirme bazı teknik gelişmeler (orta, hava-sıvı arayüzey odası, oda bir çift kişilik perfüzyon ile görüntüleme) yönelik vurgular.
Introduction
Mikroglial hücreleri beynin ikamet makrofajlar vardır ve her iki fizyolojik ve patolojik koşulları1,2‘ bir rol oynamaktadır. Onlar çok dallı bir kara delik var ve sürekli genişletme ve onların işlemleri3,4geri çeker. “Tarama” Bu davranış ilgili ve onların çevre araştırması için gerekli olduğuna inanılıyor. Microglia morfolojik plastisite üç modda ifade edilir. İlk olarak, bazı bileşikler modüle hızla mikroglial Morfoloji: ATP5,6 veya NMDA5,7 akut beyin dilimleri banyo orta eklenmesi mikroglial etkileri, karmaşıklığını artırır Oysa norepinefrin6azalır. Bu efektleri (ATP ve norepinefrin) mikroglial reseptörler tarafından doğrudan aracılı veya nöronlar bir ATP sürümü (NMDA) gerektirir. İkinci olarak, mikroglial işlemleri, motilite veya “gözetim”, olarak adlandırılan büyüme ve geri çekme hızı hücre dışı Etkenler8, homeostasis kesintileri9,10veya mutasyonlar9tarafından etkilenebilir, 10,11. Üçüncü olarak, Morfoloji ve hareketliliği bu izotropik değişikliklerin yanı sıra, onların oluşum directionally bir pipet ATP3,5,12, teslim doğru genişletmek için kapasite var microglia 13 , 14, kültür, akut beyin dilimler veya içinde vivo veya teslim 5-HT akut beyin dilimleri15dakika sonra. Tür odaklı büyüme yönlü hareketliliği, adı da verilen mikroglial süreçlerinin ilk yerel lazer lezyon3,4yanıt olarak tanımlanmıştır. Böylece, fizyolojik olarak, yanıt sakatlığı ile ilgili veya olabilir mikroglial süreçleri sinapslarda doğru hedeflemek için gerekli veya ayıklama geliştirme15,16sırasında veya fizyolojik17 gerektiren beyin bölgeleri ,18,19 veya erişkin dönemde patolojik durumlar9,18,19,20 . Morfolojik değişiklikler üç tür farklı hücre içi mekanizmalar11,13,20tarihinde itimat ve bir verilen bileşik mutlaka hepsini (dolaylı olarak üzerinde hareket eden Örneğin, NMDA, modüle değil microglia, kara delik üzerinde bir etkisi yoktur ancak yön hareketliliği5,7teşvik değil). Bu nedenle, bir bileşik, bir mutasyon veya bir patoloji etkisi microglia karakterize amaçlayan zaman onların morfolojik plastisite üç bileşenden karakterize etmek önemlidir. Burada, mikroglial işlemleri burada olan bir yerel kaynak bileşik, ATP veya 5-HT doğru yönlü gelişimini incelemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Microglia süreçleri cazibe çalışmaya çeşitli modelleri vardır: birincil kültürler 3D çevre6,18,19, akut beyin dilimleri6,13,15ve vivo 3,13görüntüleme. İçinde vivo yaklaşım en iyisi microglia fizyolojik durumunu korumak için. Ancak, derin bölgeler intravital görüntüleme karmaşık cerrahi işlemler gerektirir ve bu nedenle, bu kez yüzeysel kortikal katmanlara sınırlıdır. Microglia birincil kültür koşulları ile sınırlı sayıda hayvan, çok sayıda test etmek için en kolay tekniği kullanılır. Yine de, aynı hücre morfolojisi vivo olduğu gibi elde edebilmek mümkün değildir ve fizyolojik ilişkileri nöronlar ve astrocytes hücreleri kaybetmek. Bu iki yaklaşım arasında bir uzlaşma akut beyin dilimleri temsil eder. Bu modeli araştırmacılar Transkraniyal mikroskobu çoğunlukla yetişkinlik gerçekleştirilir, ancak Aksi takdirde zor ulaşmak için ve içinde vivo yüksek çözünürlükte görüntü ve dilimleri yenidoğan aşamaları, üzerinden araştırmak için beyin yapıları çalışmaya izin verir. Son olarak, bu gerçek zamanlı olarak yerel uyuşturucu uygulama etkilerini gözlemlemek ve deney hayvanları sınırlı sayıda kullanırken tekrar mümkün kılar. Yine de, hangi sırasında kalmak hücreleri saat21,22 canlı fareler iki hafta ve microglia morfoloji olası değişikliği büyük dilim için özellikle sınırlı bir süre (birkaç saat) akut beyin dilimleri ile ilgili bir sorun olduğunu .
Burada, biz genç ve yetişkin Cx3cr1 dilim akut beyin hazırlamak için bir protokol tarifGFP / + fareler eski microglia Morfoloji ve motilite korunması için birkaç saat ile iki aya kadar. Biz, sonra bu dilimler mikroglial süreçleri ATP veya 5-HT gibi bileşikler doğru cazibe çalışma için nasıl kullanılacağını açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İçinde ayrışmış aksine tutarak, veya organotypic dilim kültür, yapısal bütünlük ve sınırlı bir ağ ayarlamaları, akut beyin dilimleri araştırmacılar microglia fizyolojik onların ortamında çalışmaya izin. Ancak, bir büyük sınırlamaları Dilimleme yordam hızla özellikle yetişkin beyindeki nöronların canlılığı olumsuz etkileyebilir yaralanma oluşturur gerçektir. Microglia olduğu gibi özellikle hücre hasarı için reaktif nöronal hücre ölümü microglia fizyolojik durumlarına yak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz hücre ve doku Imaging tesis Institut du Fer à Moulin, nerede tüm resim alma ve analiz gerçekleştirilmiş, teşekkür ederim. Bu eser kısmen Centre National de la tarafından Recherche Scientifique, Institut National de la Santé desteklenen et de la Recherche Médicale, Sorbonne Université Bilimler ve hibe Sorbonne Universités Pierre tarafından et Marie Curie Üniversitesi () Emergence-UPMC programı 2011/2014), Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, Fondation pour la Recherche Médicale “Equipe FRM DEQ2014039529”, araştırma (Agence Nationale pour la Recherche Fransız Bakanı ANR-17-CE16-0008 ve Investissements d’Avenir “Biyo-Psy Labex” ANR-11-IDEX-0004-02 program) ve bir ortak araştırma Ulusal Bilim Vakfı/Fransız Ulusal Ajansı araştırmaları için Hesaplamalı nörolojik programında (sayı: 1515686). Her yazarlar araştırma için bağlı olan Grup üyeleri Paris Okulu Neuroscience (ENP) ve biyo-Psy Labex olan. Fe bağlı Sorbonne Université, Collège doktora, F-75005 Paris, Fransa, ile bir doktora öğrencisi ve biyo-Psy Labex tarafından finanse edilmektedir. M. olan Ulusal Bilim Vakfı/Fransız Ulusal Ajansı araştırmaları için Hesaplamalı nörolojik programında ortak araştırma tarafından finanse edilen bir Post-Doktora Bursu (sayı: 1515686). Yazarlar proje başlama katılan Marta Kolodziejczak teşekkür ederim.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), 231-239 (1999).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
