Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.
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방법 논문
Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상
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이 논문에서
요약
초록
Microglial 세포는 상주 타고 난 면역 세포는 뇌의 지속적으로 그들의 긴 프로세스와 그들의 환경을 스캔 하 고, 항상성 장애 시 빠른 형태학 상 변화를 받 다. 예를 들어 레이저 병 변 몇 분에 상해의 사이트를 향해 "방향 운동" 라고도 하는 microglial 프로세스의 중심된 성장을 유도 합니다. 로컬 ATP 또는 세로토닌 (5-hydroxytryptamine [5-HT])를 제공 하 여 비슷한 효과 얻을 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 프로토콜 ATP 또는 5-젊은 성인 쥐의 급성 뇌 조각에 HT의 로컬 응용 프로그램으로 microglial 프로세스의 방향 성장을 유도 하 고 시간이 지남에 따라이 매력 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 이미지를 설명 합니다. 무료 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어와 정량화의 간단한 방법을 제안 했다. 여전히 급성 뇌 조각 특징 도전은 감소 하는 세포 생리 상태에 남아 나이 제한 된 시간 이다. 이 프로토콜, 따라서, 특히 성인 쥐에서 조각에에서 몇 시간 동안 microglial 세포의 생존 능력을 최적화 겨냥 한 몇 가지 기술적인 개선 (중간, 공기-액체 인터페이스 챔버, 이중 관류와 챔버 이미징) 하이라이트.
서론
Microglial 세포 두뇌의 주민 대 식 세포는 고 두 생리 및 병 적인 조건1,2에 역할. 그들은 높게 분기 형태와는 끊임없이 확장 있고 그들의 프로세스3,4를 제거. 이 "스캔" 문제가 관련 되며 그들의 주위에의 조사에 필요한 여겨진다. Microglia의 형태소가 소성 세 가지 모드에 표시 됩니다. 첫째, 일부 화합물 빠르게 microglial 형태학을 조절: ATP5,6 또는 급성 뇌 조각 입욕 하는 매체에 NMDA5,7 microglial 파급 효과의 복잡성 증가 반면 norepinephrine 그것6감소 한다. 이러한 효과 직접 (대 한 ATP 및 norepinephrine) microglial 수용 체에 의해 중재 하거나 신경 세포에서 ATP 릴리스 (NMDA)에 대 한 필요 합니다. 둘째, 운동 성 또는 "감시", m....
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프로토콜
모든 실험 지역 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 (다윈 위원회, 계약 # 1170와 #10921).
1. 유리 Micropipettes 화합물의 로컬 응용 프로그램에 대 한 준비
- 준비 붕에서 펫 전극 끌어당기는 사람와 얇은 유리 모 세관. 그들의 말단에 4-5 µ m 직경을 가진 펫을 얻기 위해 매개 변수를 조정 합니다. 그림 2D 낮은 확대율에서 대물에 한 피 펫을 보여줍니다.
2입니다. 솔루션
- 압력솥 사이클에 의해 청소 하는 유일한 유리를 확인 하십시오, 뒤에 헹 구는 2 x-초순, 3 x 사용 됩니다. 절대 사용 유리 paraformaldehyde 접촉 되었습니다.
-
2 mol·를 준비 L-1 14.7 mg CaCl2·2H2O 고 순도의 물 50 mL에 용 해 하 여 CaCl2 재고 솔루션 (초순, 저항 18.2 m ω, 증류수 또는 수돗물에 금속의 흔적 차선 슬라이스 품질 때문에 발생할 수 있습니다 프로 산화 효과)입니다.
- 한 달의 최대 실내 온....
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결과
이 프로토콜 유도, 관찰, 및 로컬로 적용된 화합물 향해 microglial 프로세스의 중심된 성장 계량 하는 방법에 설명 합니다, 예를 들어 ATP 또는 5-HT, 급성 뇌에 영 또는 성인에서 조각 (적어도 까지의 2 개월) 쥐. 몇 시간 동안 건강 한 상태에서 성인 동물에서 뇌 조각을 유지에 기여 하는 요인 들 중 프로토콜의 2 단계에서 세포 생존을 최적화 하도록 설계 된 두 개의 도구를 사용 하 여가 이다. 첫째, 인터페이스 조각 소유자 인터페이스 챔버 (그림 1)에서 절단 후 조각의 보존을 향상 시킵니다. 둘째, 녹음 실 (그림 2) 제도가 관류 이미징 동안 맨 한 조각의 하단에 실행 실제 수 있습니다. 여기 사용 녹음 실 치수 (62 m m 외부 직경으로), 클래식 목욕 챔버 삽입 비슷합니다 하지만 그들의 모델은 보충 자료다운.......
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토론
유지, 달리에서 해리 또는 organotypic 슬라이스 문화, 구조적 무결성 제한 된 네트워크 조정, 급성 뇌 조각 허용 microglia 그들의 생리 적인 환경에서 공부 하는 연구자. 그러나, 주요 한계 중 하나는 조각화 절차 빠르게 특히 성인 두뇌에서에서 뉴런의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 부상 만듭니다 사실 이다. Microglia 특히 세포 손상에 반응으로, 그것은 가능한 그들의 생리 적인 상태에 가까운 microglia를 유지 하기 위해 신경 세포 죽음을 제한 하는 것이 중요. 이, 차례로, 통해 조각의 더 일반적인 조건에 덕 원 기여 한다.
이 문서에서 설명 하는 프로토콜 적용 전기 생리학 실험, 특히 성인 쥐에서에서 몇 시간 동안 조각의 더 나은 생존을 얻기 위한 문학에서 발견 하는 몇 가지 개선 됩니다. 슬라이스 생존 나이 관련 된 차이 극복 하기 위해 우리는 콜린과 나트륨을 대체 하 고 심장 관류, 슬라이스, 및 복구 단계이 콜린 실제 매체를.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 세포와 조직의 이미징 시설 인 뒤 Fer à 무 랑, 어디 모든 이미지 수집 및 분석 수행 되었습니다 감사 합니다. 이 작품 일부는 센터 국립 드 라 검색 사이언스 인 국립 드 라 건강에 의해 지원 되었습니다 동부 표준시 드 라 공 들인 Médicale, 소 르 본 대학교 과학 그리고 소 르 본 Universités-피에르에서 교부 금에 의해 외 마리 퀴리 대학 ( Emergence-UPMC 프로그램 2011/2014)는 Fondation 부 la Recherche 쉬르 르 Cerveau, Fondation 드 프랑스에서 Fondation 라 검색 Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", 연구 (직원 회 부 라 Recherche 프랑스 정부, ANR-17-CE16-0008 및 Investissements d'Avenir 프로그램 "바이오 싸이 Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) 및 전산 신경 과학 프로그램, 연구를 위한 국립 과학 재단/프랑스 국가 기관에서에서 공동 연구 (번호: 1515686). 모든 저자는 연구 제휴는 파리 학교 신경 (ENP) 바이오 싸이 Labex의 구성원을 그룹화 합니다. F.E. 소 르 본 대학교, Collège 박사, F-75005 파리, 프랑스, 제휴 박사 학생 이며 바이오 싸이 Labex에 의해 자....
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재료
222
당 모든 솔루션에 대한 성 트 기 렌즈 aCSF Carbogen 5% CO/95% OAir Liquide France Industrie 525/50 방출 필터와 560 이색성 필터 (형광 수집 용)를 포함하는 4mm 직경의 입 를 갖도록 절단 (약 7cm)슬라이스로 제공됩니다 to 은 Serotonin hydrochloride Sigma H-9523 H0의 50mM 스톡 용액의 분취량과 동일한 마이크로 피펫 홀더 에 연결되었으며
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 피펫 준비용 | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | 필라멘트가 없는 붕규산 얇은 벽, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L, Pkg. 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| >솔루션 | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| 염화콜린 | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-포도 | Sigma | G8270 | |
| L-아스코르브산 | Sigma | A5960 | |
| 염화마그네슘 용액 1 M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| 염화칼륨 SigmaUltra >99.0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| 중탄산나트륨(NaHCO3)Sigma | S5761 | ||
| 염화나트륨(NaCl) | Sigma | S5886 | |
| 인산 나트륨 일염기 | 시그마 | S5011 | |
| 피루브산 나트륨 | 시그마 | P2256 | |
| 초순수 | MilliQ | ||
| Name | Company | >카탈로그 번호< | strong>Comments |
| for 슬라이스 준비 | |||
| 2x 200 mL 결정화 접시 | |||
| 80 mL 파이렉스 비커 | |||
| Antlia-3C 디지털 연동 펌프 | DD Biolab | 178961 | 마우스 관류 및 2-광자 챔버 관류(aCSF) |
| 용 탄화물 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| 여과지 (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman 품질 여과지, 등급 1 (기공 크기: 11µ M) |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| 식품 상자 직경 10cm, 높이 | |||
| 8cm 접착제(에틸 시아노아크릴레이트) | 록타이 | 슈퍼 접착제 3 파워 플렉스 | |
| 해마 도구(주걱) | Fine Science Tools | 10099-15 | 가장 큰 말단은 90°C로 기울어져야 합니다. |
| 아이스 | |||
| 아이리스 겸자 (곡선) | Moria | MC31 | |
| 렌즈 청소 티 | 슈 THOR LABS | ||
| 나일론 메쉬 여과 | 직경 7cm | ||
| 면도날 | 전자 현미경 과학 | 72000 | 슬라이서 |
| 메스 블레이드 | |||
| 슬라이스 인터페이스 홀더 | 집에서 만든 3D 프린팅 파일은 Supplemental | ||
| Material Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | 모델: HM 650V (진동 블레이드 마이크로톰) |
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| × 25 0.95 NA 수침 대물 | Leica Microsystems (독일) | HCX Irapo | |
| 공진 스캐너(8kHz)와 2개의 HyD 하이브리드 검출기가 있는 2광자 MP5 정립 현미경 | Leica Microsystems(독일) | ||
| Antlia-3C 디지털 연동 펌프 | DD Biolab | 178961 | |
| I1501L50R2A001 | |||
| Chameleon Ultra2 Ti를 사용한 2광자 챔버 관류용: 사파이어 레이저 | Coherent (독일) | ||
| 일회용 전사 피펫, 넓은 입 | ThermoFischer | 과학 예 : 232-11 | 5.8 mL 핀 팁, 그러나 |
| 방출 필터 SP680 | Leica Microsystems (독일) | ||
| 형광 큐브 | Leica Microsystems (독일) | ||
| 의 일정한 관류를 유지하기 위한 50mL의 ACSF가 있는 유리 비커 | |||
| 가열 시스템 | Warner Instrument Corporation | 자동 히터 컨트롤러 TC-324B | 는 관류 용액을 32°도로 유지합니다. C |
| 관류 챔버 | 집에서 만든, 3D 프린팅 용 파일은 집에서 만든 보충 재료 | ||
| 슬라이스 홀더 ( "하프") | : 평행 한 나일론 실로 결합 된 두 개의 지점이있는 백금으로 만든 머리핀 | ||
| Name | Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | be ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) 원액을 실험 당일에 준비하여 4°C로 유지했습니다. C (몇 시간) 사용 직전에 희석 |
| Fluorescein (선택 사항) | Sigma | F-6377 | 1 µ에서 사용; M 최종 |
| Micromanipulator | Luigs 및 Neumann | SM7 | |
| 전기 생리학 | |||
| -20°C에서 유지되었습니다. 500 &마이크로; M solution은 실험 당일을 준비했습니다. | |||
| 주사기 5 mL (바늘 제외) | Terumo 의료 제품 | SS + 05S1 | |
| 투명 튜브 | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics ™ 타이곤&트레이드; E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| >for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP 마우스 | Jung et al, 2000 | 수컷 또는 암컷, P3에서 2개월; 우리는 129SV 배경에서 이 마우스를 역교배했습니다. | |
| CX3CR1creER-YFP 마우스 | Parkhurst et al 2013 | 수컷 또는 암컷, P3에서 2개월; 우리는 이 마우스를 129sv 배경에서 역교배했습니다. |
참고문헌
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origi....
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재인쇄 및 허가
