שני הפוטונים הדמיה של תהליכים Microglial המשיכה לכיוון ATP או סרוטונין המוח חריפה פרוסות
Summary
מיקרוגלייה, תאים חיסוניים תושב של המוח, להגיב במהירות עם שינויים מורפולוגיים שינויים של סביבתם. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש מיקרוסקופ שני הפוטונים כדי לחקור את המשיכה של תהליכים microglial לכיוון סרוטונין או ATP פרוסות המוח חריפה של עכברים.
Abstract
Microglial תאים הם תושב מולדת תאים חיסוניים של המוח ללא הרף לסרוק את הסביבה שלהם עם תהליכים ארוכים שלהם, על הפרעה של הומאוסטזיס, עוברים שינויים מורפולוגיים מהירה. לדוגמה, פצע הלייזר גורם בעוד כמה דקות גידול מונחה של תהליכים microglial, נקרא גם “תנועתיות כיוונית”, לכיוון האתר של פציעה. ניתן להשיג אפקט דומה על-ידי אספקת מקומית ATP או סרוטונין (5-hydroxytryptamine [5-HT]). במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול לזירוז גידול כיוונית של תהליכים microglial לקראת יישום מקומי של ATP או 5-HT-פרוסות המוח חריפה של עכברים צעירים וכדי תמונה משיכה זו לאורך זמן על ידי מיקרוסקופ multiphoton. שיטה פשוטה של כימות עם תוכנת ניתוח תמונות בחינם, קוד פתוח מוצע. אתגר המאפיינת עדיין פרוסות המוח חריפה זה הזמן מוגבל, יורד עם הגיל, במהלכו התאים ישארו במצב פיזיולוגי. פרוטוקול זה, לפיכך, מדגיש כמה שיפורים טכניים (חדר בינוני, אוויר נוזלי ממשק, הדמיה קאמרית עם זלוף כפול) שמטרתם ייעול הכדאיות של תאים microglial על פני מספר שעות, במיוחד בפרוסות של עכברים בוגרים.
Introduction
Microglial תאים מקרופאגים תושב של המוח, לשחק תפקיד שני מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים1,2. הם יש מורפולוגיה מסועף מאוד ואני כל הזמן הארכת, היציבה שלהם3,של תהליכים4. זו התנהגות “סריקה” הוא האמין להיות קשורים צורך הסקר של סביבתם. הפלסטיות מורפולוגי של מיקרוגלייה מתבטאת בשלושה מצבים. ראשית, תרכובות מסוימות במהירות לווסת את microglial מורפולוגיה: התוספת של ATP5,6 או5,NMDA7 במדיום רחצה פרוסות המוח חריפה מגביר את המורכבות של השלכות microglial, ואילו נוראדרנלין מקטין אותה6. תופעות אלה הן ישירות מתווך על ידי קולטנים microglial (עבור ATP ונוראפינפרין) או לדרוש שחרור ATP של נוירונים (עבור NMDA). שנית, מהירות הצמיחה, הכחשה של תהליכים microglial, שנקרא תנועתיות או “מעקב”, יושפעו על-ידי גורמים חוץ-תאית8, הומאוסטזיס שיבושים9,10או מוטציות9, 10,11. שלישית, שבנוסף לשינויים איזוטרופיות הללו של חיות וצורות מיקרוגלייה יש את היכולת להרחיב את תהליכי שלהם directionally לכיוון פיפטה אספקת ATP3,5,12, 13 , 14, בתרבות, פרוסות המוח חריפה או ויוו, או מתן 5-HT-במוח חריפה פרוסות15. כזה הצמיחה אוריינטציה של תהליכים microglial, הנקרא גם תנועתיות כיוונית, תוארה לראשונה בתגובה המקומית לייזר הנגע3,4. לכן, מבחינה פיזיולוגית, זה ייתכן הקשורים התגובה לפגיעה או נדרש מיקוד microglial תהליכים לכיוון הסינפסות או אזורים במוח הדורשים גיזום במהלך פיתוח15,16, או פיזיולוגיות17 ,18,19 -מצבים פתולוגיים9,18,19,20 בבגרות. שלושת סוגי שינויים מורפולוגיים להסתמך על מנגנונים תאיים שונים11,13,20, מתחם נתון אחד לא בהכרח לווסת את כולן (למשל, NMDA, אשר פועל בעקיפין על מיקרוגלייה, יש השפעה על מורפולוגיה אבל לא לגרום תנועתיות כיוונית5,7). לכן, כאשר, במטרה לאפיין את ההשפעה של תרכובת, מוטציה או פתולוגיה על מיקרוגלייה חשוב לאפיין את שלושת המרכיבים של פלסטיות מורפולוגית שלהם. כאן, אנו מתארים שיטה ללמוד את צמיחת microglial תהליכים לכיוון מקור מקומי של המתחם, אשר, כאן, ATP או 5-HT-כיוונית.
ישנם מספר מודלים ללמוד משיכה מיקרוגלייה תהליכים: תרבויות ראשי בסביבה תלת-ממד6,18,19, המוח חריפה פרוסות6,13,15, וב -vivo הדמיה3,13. הגישה ויוו הוא הטוב ביותר כדי לשמר את מצב פיזיולוגי מיקרוגלייה. עם זאת, intravital הדמיה של אזורים עמוקים דורש הליכים כירורגיים מורכבים, לכן לעיתים קרובות מוגבל לשכבות קורטיקלית שטחית. השימוש מיקרוגלייה התרבות העיקרית היא הטכניקה הפשוטה ביותר לבדוק מספר רב של מצבים עם מספר מצומצם של בעלי חיים. בכל זאת, זה אפשרי להשיג המורפולוגיה תא אותו כמו vivo, תאים לאבד את יחסי הגומלין פיזיולוגיים נוירונים, האסטרוציטים. פרוסות המוח חריפה מייצגים מעין פשרה בין שתי גישות אלה. דגם זה מאפשר לחוקרים ללמוד מבנים במוח אשר אחרת קשה להגיע, כדי תמונה עם רזולוציה גבוהה ויוו, וכדי לחקור פרוסות שלבים neonatal, ואילו טראנס מיקרוסקופית מבוצע בעיקר-לבגרות. בסופו של דבר, זה מאפשר להתבונן בזמן אמת את ההשפעות של סמים מקומי יישום, וכדי לחזור על ניסויים תוך שימוש במספר מצומצם של בעלי חיים. למרות זאת, בעיה עם פרוסות המוח חריפה זה הזמן מוגבל (מספר שעות) במהלכו התאים נשארים בחיים, ובמיוחד עבור פרוסות של עכברים שגילן עולה על שבועיים, ואת השינוי פוטנציאליים מיקרוגלייה מורפולוגיה של מעל הזמן21,22 .
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להכין פרוסות המוח חריפה של צעירים ומבוגרים Cx3cr1GFP / + עכברים זקנים, עם שימור מיקרוגלייה וצורות למשך מספר שעות עד חודשיים. ואז, נתאר כיצד להשתמש פרוסות אלה ללמוד האטרקציה של תהליכים microglial לכיוון תרכובות כמו ATP או 5-HT.
Protocol
Representative Results
Discussion
על ידי שמירה על, שלא כמו בחלופה מועדפת או organotypic לחתוך תרבות, המבנית עם התאמות רשת מוגבל, פרוסות המוח חריפה לאפשר לחוקרים ללמוד מיקרוגלייה בסביבה הפיזיולוגית שלהם. עם זאת, אחת המגבלות הגדולות היא העובדה כי ההליך עם פרוסות יוצר פציעות במהירות יכול לסכן את הכדאיות של נוירונים, במיוחד במוח למב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים את התא ואת רקמת מתקן הדמיה של ה-Institut du Fer à מולן, איפה כל ייבוא תמונות וניתוח בוצעו. עבודה זו בתמיכתם באופן חלקי המרכז הלאומי דה לה של רשרש, Santé de la הלאומי אינסטיטוט et de la Médicale רשרש, המדעים אוניברסיטת סורבון, ועל -ידי מענקים מן הסורבון Universités-פייר ואח (מארי קירי אוניברסיטת תוכנית Emergence-UPMC 2011/2014), Fondation למזוג לה Recherche sur le Cerveau, Fondation דה פראנס, שופכים Fondation la Médicale רשרש “Equipe עקרות DEQ2014039529”, משרד הצרפתי של מחקר (סוכנות הידיעות נאסיונאל pour la Recherche ANR-17-CE16-0008, d’Avenir Investissements את תוכנית “ביו-פסיכולוגיים Labex” ANR-11-IDEX-0004-02), מחקר שיתופי בתוכנית בנוירוביולוגיה חישובית, לאומי-הסוכנות הלאומית של המדע קרן/צרפתית, למחקר (המספר: 1515686). כל הכותבים מזוהים לחקור קבוצות אשר הם חברים של הספר פריז of Neuroscience (ENP) ושל את Labex ביו-פסיכולוגיים. הקיבולות נשמר תלמיד דוקטורט המזוהה עם אוניברסיטת סורבון, קולז דוקטורט, F-75005 בפריז, צרפת, ממומן על ידי Labex ביו-פסיכולוגיים. V.M. הוא פוסט-דוקטורנט במימון מחקר שיתופי בתוכנית בנוירוביולוגיה חישובית, לאומי-הסוכנות הלאומית של המדע קרן/צרפתית, למחקר (המספר: 1515686). המחברים תודה מרתה Kolodziejczak שהשתתפו אתחול של הפרויקט.
Materials
| for pipettes preparation | |||
| Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries | Harvard Apparatus | 30-0065 | Borosilicate Thin Wall without Filament, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L , Pkg. of 225 |
| DMZ Universal Puller | Zeitz Instrumente | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for solutions | |||
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G8270 | |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A5960 | |
| Magnesium Chloride solution 1M (MgCl2) | Sigma | 63020 | |
| Potassium chloride SigmaUltra >99,0% (KCl) | Sigma | P9333 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S5886 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S5011 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Ultrapure water | MilliQ | for all the solutions | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice preparation | |||
| 2x 200 mL crystalizing dishes | |||
| 80 mL Pyrex beaker | |||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For mice perfusion and 2-photon chamber perfusion (aCSF) |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | ||
| Dolethal | Vetoquinol | Dolethal 50 mg/mL | |
| Filter papers (Whatman) | Sigma | WHA1001042 | Whatman qualitative filter paper, Grade 1 (Pore size: 11µM) |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14060-60 | |
| Food box 10 cm diameter, 8 cm Height | |||
| glue (ethyl cyanoacrylate) | Loctite | super glue 3 power flex | |
| Hippocampal Tool (spatula) | Fine Science Tools | 10099-15 | The largest extremity has to be angled at 90 ° |
| Ice | |||
| Iris Forceps (curved) | Moria | MC31 | |
| Lens cleaning tissue | THOR LABS | ||
| Nylon mesh strainer | diameter 7 cm | ||
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | For the slicer |
| scalpel blade | |||
| Slice interface holder | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| Surgical Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Vibrating slicer | Thermo Scientific | 720-2709 | Model: HM 650V (Vibrating blade microtome) |
| Water bath | Set at 32°C (first recovery step) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice imaging | |||
| × 25 0.95 NA water-immersion objective | Leica Microsystems (Germany) | HCX Irapo | |
| 2-photon MP5 upright microscope with resonant scanners (8 kHz) and two HyD Hybrid detectors | Leica Microsystems (Germany) | ||
| Antlia-3C Digital Peristaltic pump | DD Biolab | 178961 | For 2-photon chamber perfusion with aCSF |
| Carbogen 5% CO2/95% O2 | Air Liquide France Industrie | I1501L50R2A001 | |
| Chameleon Ultra2 Ti:sapphire laser | Coherent (Germany) | ||
| disposable transfer pipettes , wide mouth | ThermoFischer scientific | for example : 232-11 | 5.8ml with fin tip, but we cut it (approx 7cm) to have a 4 mm diameter mouth |
| emission filter SP680 | Leica Microsystems (Germany) | ||
| fluorescent cube containing a 525/50 emission filter and a 560 dichroic filter (for fluorescence collection) | Leica Microsystems (Germany) | ||
| glass beaker with 50 mL of ACSF to maintain constant perfusion of the slice | |||
| Heating system | Warner Instrument Corporation | Automatic Heater Controller TC-324B | to maintain perfusion solution at 32°C |
| perfusion chamber | home-made, the file for 3D printing is provided in Supplemental Material | ||
| slice holder ("harp") | home made : hairpin made of platinum with the two branches joined by parallel nylon threads | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for slice stimulation | |||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A-26209 | to be prepared ex-temporaneously : 1mg/ml (3mM) stock solution prepared the day of the experiment, kept at 4°C (a few hours) and diluted just before use |
| Fluorescein (optional) | Sigma | F-6377 | use at 1 µM final |
| Micromanipulator | Luigs and Neumann | SM7 | connected to the micropipette holde |
| Micropipette holder | same as for eletrophysiology | ||
| Serotonin hydrochloride | Sigma | H-9523 | aliquots of 50mM stock solution in H20 kept at -20°C. 500µM solution prepared the day of the experiment. |
| Syringe 5mL (without needle) | Terumo medical products | SS+05S1 | |
| Transparent tubing | Fischer Scientific | 11750105 | Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon™ E-3603 Non-DEHP Tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| for image analysis | |||
| Fiji | https://fiji.sc | Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038 | |
| Icy | Institut Pasteur | http://icy.bioimageanalysis.org | de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mice | |||
| CX3CR1-GFP mice | Jung et al, 2000 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. | |
| CX3CR1creER-YFP mice | Parkhurst et al 2013 | male or females, P3 to 2 months-old ; we have backcrossed these mice on 129sv background. |
References
- Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
- Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;. Microglia across the lifespan: from origin to function in brain development, plasticity and cognition. The Journal of Physiology. , (2016).
- Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature Neuroscience. 8 (6), 752-758 (2005).
- Nimmerjahn, A. Resting Microglial Cells Are Highly Dynamic Surveillants of Brain Parenchyma in Vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Dissing-Olesen, L., et al. Activation of neuronal NMDA receptors triggers transient ATP-mediated microglial process outgrowth. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10511-10527 (2014).
- Gyoneva, S., Traynelis, S. F. Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors. Journal of Biological Chemistry. 288 (21), 15291-15302 (2013).
- Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (32), 10528-10540 (2014).
- Hristovska, I., Pascual, O. Deciphering Resting Microglial Morphology and Process Motility from a Synaptic Prospect. Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 1231 (2016).
- Avignone, E., Lepleux, M., Angibaud, J., Nägerl, U. V. Altered morphological dynamics of activated microglia after induction of status epilepticus. Journal of Neuroinflammation. 12, 202 (2015).
- Abiega, O., et al. Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling. PLoS Biology. 14 (5), e1002466 (2016).
- Madry, C., et al. Microglial Ramification, Surveillance, and Interleukin-1β Release Are Regulated by the Two-Pore Domain K+Channel THIK-1. Neuron. 97 (2), 299-312 (2018).
- Honda, S., et al. Extracellular ATP or ADP induce chemotaxis of cultured microglia through Gi/o-coupled P2Y receptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (6), 1975-1982 (2001).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nature Neuroscience. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Wu, L. -. J., Vadakkan, K. I., Zhuo, M. ATP-induced chemotaxis of microglial processes requires P2Y receptor-activated initiation of outward potassium currents. Glia. 55 (8), 810-821 (2007).
- Kolodziejczak, M., et al. Serotonin Modulates Developmental Microglia via 5-HT 2BReceptors: Potential Implication during Synaptic Refinement of Retinogeniculate Projections. ACS Chemical Neuroscience. 6 (7), 1219-1230 (2015).
- Schafer, D. P., et al. Microglia Sculpt Postnatal Neural Circuits in an Activity and Complement-Dependent Manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Pfeiffer, T., Avignone, E., Nägerl, U. V. Induction of hippocampal long-term potentiation increases the morphological dynamics of microglial processes and prolongs their contacts with dendritic spines. Scientific Reports. 6, 32422 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia Promote Learning-Dependent Synapse Formation through Brain-Derived Neurotrophic Factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends in Immunology. 36 (10), 605-613 (2015).
- Ohsawa, K., et al. P2Y12 receptor-mediated integrin-beta1 activation regulates microglial process extension induced by ATP. Glia. 58 (7), 790-801 (2010).
- Kurpius, D., Wilson, N., Fuller, L., Hoffman, A., Dailey, M. E. Early activation, motility, and homing of neonatal microglia to injured neurons does not require protein synthesis. Glia. 54 (1), 58-70 (2006).
- Stence, N., Waite, M., Dailey, M. E. Dynamics of microglial activation: a confocal time-lapse analysis in hippocampal slices. Glia. 33 (3), 256-266 (2001).
- Dissing-Olesen, L., Macvicar, B. A. Fixation and Immunolabeling of Brain Slices: SNAPSHOT Method. Current Protocols in Neuroscience. 71, (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Paris, I., et al. ProMoIJ: A new tool for automatic three-dimensional analysis of microglial process motility. Glia. 66 (4), 828-845 (2018).
- Pagani, F., et al. Defective microglial development in the hippocampus of Cx3cr1 deficient mice. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (229), 111 (2015).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. , 221-242 (2014).
- Mainen, Z. F., et al. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18 (2), 231-239 (1999).
- Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
- Gyoneva, S., et al. Systemic inflammation regulates microglial responses to tissue damage in vivo. Glia. 62 (8), 1345-1360 (2014).
- Heindl, S., et al. Automated Morphological Analysis of Microglia After Stroke. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 106 (2018).
- Dailey, M. E., Eyo, U., Fuller, L., Hass, J., Kurpius, D. Imaging microglia in brain slices and slice cultures. Cold Spring Harbor Protocols. 12 (12), 1142-1148 (2013).
