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생화학

Erforschung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen mit Atomic Force Microscopy Imaging

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Charakterisierung von Nukleosom Partikel auf der Einzelmolekül-Ebene mit statischen und Zeitraffer Rasterkraftmikroskopie (AFM) bildgebende Verfahren. Die Oberfläche Funktionalisierung beschriebene Methode ermöglicht die Erfassung der Struktur und Dynamik der Nukleosomen in hoher Auflösung im Nanobereich.

Abstract

Chromatin, die eine lange Kette von Nukleosom Untereinheiten ist, ist ein dynamisches System, das für solche kritischen Prozesse ermöglicht, als DNA-Replikation und Transkription, nehmen in eukaryotischen Zellen. Die Dynamik der Nukleosomen ermöglicht den Zugriff auf die DNA von Replikation und Transkription Maschinen und kritisch zu den molekularen Mechanismen Chromatin Funktionen trägt. Einzelmolekül-Studien wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) imaging trugen erheblich zur unser gegenwärtiges Verständnis der Rolle der Nukleosom Struktur und Dynamik. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Schritte, die es ermöglicht hochauflösende AFM bildgebende Verfahren, die strukturelle und dynamische Eigenschaften der Nukleosomen zu studieren. Das Protokoll wird illustriert durch AFM Daten für das Zentromer Nukleosomen bei denen Histon H3 mit seinen Amtskollegen Zentromer Protein A (CENP-A) ersetzt wird. Das Protokoll beginnt mit der Montage der Mono-Nukleosomen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode. Die Vorbereitung des Glimmer Substrats funktionalisiert mit Aminopropyl Silatrane (APS-Glimmer), die für das Nukleosom-Bildgebung verwendet wird ist von entscheidender Bedeutung für die AFM-Visualisierung von Nukleosomen beschrieben und das Verfahren, das Substrat vorzubereiten wird erläutert. Nukleosomen hinterlegt auf der APS-Glimmer-Oberfläche werden zuerst abgebildet mit statischen AFM, die eine Momentaufnahme der Nukleosom Bevölkerung erfasst. Aus Analysen dieser Bilder Parameter wie die Größe der DNA umwickelt die Nukleosomen gemessen werden und dieser Prozess ist auch detailliert. Die Time-Lapse AFM bildgebende Verfahren in der Flüssigkeit ist für die High-Speed-Zeitraffer-AFM, die mehrere Frames erfassen können beschrieben Nukleosom Dynamik pro Sekunde. Schließlich ist die Analyse der Nukleosom Dynamik ermöglicht die quantitative Charakterisierung der dynamischen Prozesse beschrieben und illustriert.

Introduction

In eukaryotischen Zellen ist DNA hoch verdichteten und in Chromosomen organisierte. 1 die erste Ebene der DNA-Organisation innerhalb eines Chromosoms ist die Versammlung der Nukleosomen welche 147 bp DNA ist ein Histon Octamer Kern fest umwickelt. 2 , 3 Nukleosom Partikel montieren auf einem langen DNA-Molekül bilden ein Chromatin-Array, dann organisiert wird, bis eine kompakte Chromosom Einheit gebildet wird. 4 die Demontage des Chromatins Zugriff auf kostenlose DNS durch wichtige zelluläre Prozesse wie gen-Transkription und Genom-Replikation, was darauf hindeutet, dass das Chromatin ist ein sehr dynamisches System. 5 , 6 , 7 die dynamischen Eigenschaften der DNA auf verschiedenen Ebenen von Chromatin zu verstehen ist von entscheidender Bedeutung für die Aufklärung der genetischen Prozesse auf molekularer Ebene, wo Fehler zu Zelltod oder die Entstehung von Krankheiten wie Krebs führen kann. 8 eine Chromatin-Eigenschaft von großer Bedeutung ist die Dynamik der Nukleosomen. 9 , 10 , 11 , 12 die hohe Stabilität dieser Teilchen hat für die strukturelle Charakterisierung von kristallographischen Techniken erlaubt. 2 was diese Studien-Mangel sind die dynamischen Details der Nukleosomen wie der Mechanismus der DNA aus dem Histon-Kern Auspacken; der dynamische weg davon ist erforderlich für die Transkription und Replikation. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 darüber hinaus sind spezielle Proteine bezeichnet umgestaltet Faktoren gezeigt worden, die Demontage der nucleosomal Partikel17zu erleichtern; die innere Dynamik der Nukleosomen ist jedoch der entscheidende Faktor in diesem Prozess, der zur gesamten Demontage beiträgt. 14 , 16 , 18 , 19

Einzelmolekül-Techniken wie Einzelmolekül-Fluoreszenz19,20,21, optische fallen (Pinzette)13,18,22,23 und AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 haben maßgeblich für das Verständnis der Dynamik der Nukleosomen. Unter diesen Verfahren profitiert AFM mehrere einzigartige und attraktive Features. AFM erlaubt es, zu visualisieren und zu charakterisieren, individuelle Nukleosomen sowie längere Arrays27. Von AFM Bilder können wichtige Merkmale der Nukleosom Struktur wie die Länge der DNA um die Histon-Kern gewickelt gemessenen 10,14,26,28; ein Parameter, der die Charakterisierung der Nukleosom Auspacken Dynamik im Mittelpunkt steht. Vorbei an AFM haben Studien ergeben Nukleosomen hochdynamische Systeme und DNA spontan aus dem Histon Kern14auspacken kann. Die spontane Auspacken der DNA von Nukleosomen wurde direkt von AFM Betrieb im Zeitraffer-Modus, wenn die Bildgebung in wässrigen Lösungen 14,26,29 erfolgtvisualisiert.

Das Aufkommen der High-Speed-Zeitraffer AFM (HS-AFM) Instrumentierung ermöglichte es den Nukleosom Auspacken Prozess um die Millisekunde Zeitskala 14,15,24zu visualisieren. HS-AFM 16,30 Studien von spezifischen Nukleosomen Zentromer offenbart einige Neuerungen die Nukleosomen im Vergleich mit den kanonischen Typ. Zentromer Nukleosomen bilden der Zentromer, ein kleiner Teil des Chromosoms für Chromosom Abtrennung31von entscheidender Bedeutung. Im Gegensatz zu kanonischen Nukleosomen in loser Schüttung Chromatin enthält der Histon-Kern des Centromers Nukleosomen CENP-A Histon statt Histon H332,33. Als Folge dieser Histon-Substitution ist DNA-Verpackung in Zentromer Nukleosomen ~ 120 bp statt der ~ 147 bp für kanonische Nukleosomen; ein Unterschied, der zu verschiedenen Morphologien der Zentromer und kanonische Nukleosomen führen kann arrays34, was darauf hindeutet, dass das Zentromer Chromatin höhere Dynamik im Vergleich mit der Masse eines erfährt. Die neuartige Dynamik angezeigt durch Zentromer Nukleosomen in HS-AFM16,30 Studien veranschaulichen die einmalige Gelegenheit von dieser Einzelmolekül-Technik zur Verfügung gestellt, die strukturelle und dynamische Eigenschaften direkt sichtbar zu machen Nukleosomen. Beispiele für diese Features werden kurz diskutiert und am Ende des Papiers dargestellt. Diese Fortschritte wurden durch die Entwicklung von neuartigen Protokolle für AFM Bildgebung der Nukleosomen sowie Änderungen bestehender Methoden. Das Ziel des hier beschriebenen Protokolls soll diese spannende Fortschritte in Einzelmolekül-AFM Nukleosom Studien für jedermann zugänglich zu machen, die diese Techniken in ihrer Chromatin-Untersuchungen nutzen möchten. Viele der beschriebenen Techniken gelten für Probleme über das Studium der Nukleosomen und eignet sich für Untersuchungen von anderen Proteinen und DNA-Systeme von Interesse. Ein paar Beispiele für solche Anwendungen finden Sie in Publikationen35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 und Perspektiven von AFM Studien verschiedene Biomolekulare Systeme gegeben in29,50,51,53,54Bewertungen.

Protocol

1. kontinuierliche Verdünnung Montage von Mono-Nukleosomen Generieren und reinige ein ca. 400 bp DNA Substrat, das ein-zentrierten Widom 601 Nukleosom Positionierung Sequenz enthält. 55Hinweis: Um die unerwünschten Bildung von di-Nukleosomen beschränken, jede ‘Arm’ flankieren die Positioniervorgang sollte nicht mehr als ~ 150 bp. Verwenden Sie Plasmid pGEM3Z-601 sowie die gestalteten Primer und verstärken Sie die Substrat-DNA mittels PCR. Für die 423 bp-Substrat mit 122…

Representative Results

Mono-Nukleosomen wurden zunächst für AFM vorbereitet bildgebende Untersuchungen mit einer kontinuierlichen Verdünnungsmethode der Montage (Abbildung 1). Die vorbereiteten Nukleosomen wurden dann überprüft mit diskontinuierlichen SDS-PAGE (Abbildung 2). Eine Glimmer-Oberfläche wurde als nächstes funktionalisiert mit APS, die Nukleosomen an der Oberfläche erfasst und gleichzeitig einen reibungslosen Hintergrund für hochauflösende Bildgebung (<strong clas…

Discussion

Das oben beschriebene Protokoll ist eher einfach und hoch reproduzierbare Ergebnisse liefern, obwohl ein paar wichtige Themen hervorgehoben werden können. Funktionalisierten APS-Glimmer ist ein wichtiger Substrat für immer zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse. Eine hohe Stabilität der APS-Glimmer ist eines der wichtigsten Merkmale dieses Substrat, das ermöglicht eine bildgebende Substrat für den Einsatz vorbereiten, die mindestens zwei Wochen nach Zubereitung verwendet werden können. 59</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Beiträge Autor: YLL und MSD entwickelt das Projekt; MSD montiert Nukleosomen. MSD und ZS durchgeführt AFM-Experimente und Daten-Analysen. Alle Autoren schrieb und das Manuskript bearbeitet.

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
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References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. o. p. h. i. e. E., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. 생화학. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. e. e. t. a. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Chellappan, S. P. . Chromatin Protocols. , 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. 생화학. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. 생화학. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L., Meyers, R. . Encyclopedia of Analytical Chemistry. , 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L., Lyubchenko, Y. L. . Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. , 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. “Antiparallel” DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. 생화학. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. 생화학. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. 생화학. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L., Taatjes, D. J., Roth, J. . Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. , 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T., Braga, P. C., Ricci, D. . Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. , 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. . Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. 생화학. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. 생화학. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. 생화학. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. 생화학. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. 생화학. 47 (43), 11204-11211 (2008).

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Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
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