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생화학

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM) イメージング技術を使用して単一分子レベルでのヌクレオソーム粒子の特性評価にプロトコルを提案します。説明表面機能化手法により構造のキャプチャとダイナミクスのヌクレオソームのナノスケールで高解像度。

Abstract

ヌクレオソームのサブユニットの長い鎖であるクロマチンは、真核細胞の DNA 複製と転写を場所としてこのような重要なプロセスは、動的なシステムです。ヌクレオソームのダイナミクスは、dna 複製と転写の機械によってアクセスが提供し、クロマチン機能発現の分子機構に非常に貢献します。イメージング原子間力顕微鏡 (AFM) など単一分子の研究は、ヌクレオソーム構造とダイナミクスの役割の私達の現在の理解に大きく貢献しています。現在のプロトコルは、ヌクレオソームの構造と動的性質の研究に高分解能 AFM イメージングを有効にする手順を説明します。プロトコルは、H3 ヒストンがその相手の動原体タンパク質 (セントロメア) に置き換えられますセントロメア ヌクレオソームの得られた原子間力顕微鏡データによって示されています。プロトコルは連続希釈法によるモノラル ヌクレオソームのアセンブリに始まります。基板を準備する手順は、説明および説明ヌクレオソームの原子間力顕微鏡可視化修飾とヌクレオソーム イメージングに使用されるアミノプロピル silatrane (APS-雲母) マイカ基板の準備が欠かせません。ヌクレオソーム APS 雲母表面上まずヌクレオソーム人口のスナップショットをキャプチャする静的 AFM を用いたが作成されます。これらの画像解析からラップされたヌクレオソーム DNA のサイズなどのパラメーターを計測でき、このプロセスはまた、詳細な。液体内のプロシージャをイメージング タイムラプス AFM はいくつかのフレームをキャプチャすることができます高速コマ撮り AFM について 1 秒あたりヌクレオソーム ダイナミクスの。最後に、動的過程の定量的な解析を有効にするヌクレオソーム ダイナミクスの解析が説明し、イラストします。

Introduction

真核細胞の DNA は高度に凝縮し、染色体に組織です。1染色体内の DNA 組織の最初のレベルは、147 のヌクレオソームのアセンブリ DNA の bp は密ヒストン八量体コアに巻いた。2,3ヌクレオソーム粒子単位で非常に小型の染色体が形成されるまではそれから組織されるクロマチンの配列を形成する長鎖 DNA 分子を組み立てます。4クロマチンの分解は DNA 遺伝子の転写とゲノムの複製など重要な細胞プロセスで必要とされる、クロマチンが非常に動的なシステムを無料へのアクセスを提供します。5,6,7さまざまなクロマチン レベルで DNA の動的プロパティを理解が間違いが細胞死やがんなどの病気の開発につながることができる分子レベルの遺伝的プロセスを解明するため重要です。8重要なクロマチン プロパティはヌクレオソームのダイナミクスです。9,10,11,12これらの粒子の高い安定性が結晶学的手法による構造特性できました。2どのようなこれらの研究不足、ヌクレオソーム DNA のメカニズムなどの動的詳細アンラッピング ヒストン コアから動的な経路は転写および複製の過程で必要です。7,9,13,14,15,16また、因子と呼ばれる特別な蛋白質ヌクレオソーム粒子17の分解を容易にするために示されています。ただし、ヌクレオソームの本質的なダイナ ミックスは全体分解プロセスに貢献するこのプロセスで重要な要因であります。14,16,18,19

単一分子蛍光19,20,21、光学トラップ (ピンセット)13,18,22,23 AFM などの単一分子技術10,14,15,16,24,25,26はヌクレオソームのダイナミクスを理解することに尽力されています。これらの方法のいくつかのユニークで魅力的な機能から原子間力顕微鏡の利点します。原子間力顕微鏡を視覚化しより長い配列27と同様、ヌクレオソームを特徴付けることができます。AFM 像からヌクレオソーム構造 DNA のヒストンのコアの周りをラップの長さなどの重要な特性は、測定10,14,26,28をすることができます。ヌクレオソーム アンラップ ダイナミクスの解析の中核となるパラメーターです。過去の原子間力顕微鏡の研究は非常に動的なシステム、DNA がヒストン コア14から自発的にラップを解除できますヌクレオソームを明らかに。ヌクレオソームから DNA の自発的な開梱は afm イメージングが水溶液14,26,29終わったらタイムラプス モードで動作直接可視化した.

高速コマ撮り原子間力顕微鏡 (AFM HS) 計測器の出現は、ミリ秒のタイム スケール14,15,24ヌクレオソーム アンラッピングを可視化を可能にしました。セントロメア特定ヌクレオソームの最近の HS AFM 16,30研究では、標準型に比べヌクレオソームのいくつかの新しい機能を明らかにしました。動原体、染色体分離31の批判的に重要な染色体の一部分のセントロメア ヌクレオソームを構成します。一括クロマチンの正規ヌクレオソームとは異なりは、セントロメア ヌクレオソームのヒストンのコアにはヒストン H332,33ではなくセントロメア ヒストンが含まれています。このヒストン置換結果のセントロメア ヌクレオソーム DNA ラッピングは ~ 120 ~ 147 ではなく bp 正規ヌクレオソーム; の bpセントロメアと正規のヌクレオソームの明瞭な形態をもたらすことができる違いは配列34セントロメア クロマチンを受ける 1 一括に比べ高いダイナミクスを示唆しています。HS AFM16,30研究におけるセントロメア ヌクレオソームで表示される新しいダイナミクス例示の構造と動的特性を直接可視化するこの 1 分子技術によって提供されるユニークな機会ヌクレオソーム。これらの機能の例を簡単に説明し、用紙の端に示されているが。既存のメソッドの変更と同様、ヌクレオソームの AFM イメージングの新しいプロトコルの開発により進歩だった。ここで説明したプロトコルの目的は、単一分子の原子間力顕微鏡のヌクレオソームの研究でこれらの刺激的な進歩のクロマチンの調査でこれらのテクニックを利用したいと思います誰かにアクセスできるようにです。説明されている技法の多くは、ヌクレオソームの研究を超えて問題に適用され他の蛋白質および興味の DNA システムの調査のため使用することができます。出版物35,36,37,38,39,40,41、このようなアプリケーションのいくつかの例を見つけることができます。 42,43,44,45,46,47,48,49と原子間力顕微鏡学の展望様々 な生体分子システムを与えられているレビュー29,50,51,53,54。

Protocol

1. 連続希釈モノラル ヌクレオソームのアセンブリ 生成し、シーケンスを配置オフ中心の Widom 601 ヌクレオソームを含む約 400 bp の DNA 基質を浄化します。55注: 不要なディ ヌクレオソーム形成を制限する位置決めシーケンスの前後それぞれの ‘腕’ を超えない ~ 150 bp。 設計されたプライマーと一緒にプラスミド pGEM3Z 601 を使用して PCR を使用して基板の DNA を?…

Representative Results

モノラル ヌクレオソーム最初、afm イメージング実験の連続希釈アセンブリ メソッド (図 1) を使用して作製した.準備のヌクレオソームは、不連続 SDS ページ (図 2) を使用してがチェックされたし。雲母表面は次に、APS は、高分解能観察 (図 3) の滑らかな背景を維持しながら表面のヌクレオソームをキャプチャを使用して官能…

Discussion

上記で説明したプロトコルはむしろ簡単で、再現性の高い結果を提供しますが、いくつかの重要な問題を強調することができます。官能 AP 雲母は、信頼性と再現性のある結果を得るためキー基板です。APS マイカの高安定性は、画像処理基板を準備されている後少なくとも 2 週間使用できます使用を事前に準備することができますこの基板の重要な機能の 1 つです。59,</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者の貢献: YLL と MSD 設計プロジェクトMSD は、ヌクレオソームを組み立てられます。MSD と ZS は、AFM 実験とデータ解析を実行しました。すべての著者を書いて、原稿を編集します。

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
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Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
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