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Biochemistry

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

Abstract

Cromatina, che è una lunga catena di subunità nucleosoma, è un sistema dinamico che permette tali processi critici come replicazione del DNA e la trascrizione di prendere posto nelle cellule eucariotiche. La dinamica dei nucleosomi fornisce l'accesso al DNA di replicazione e trascrizione macchinari e criticamente contribuisce ai meccanismi molecolari sottostanti le funzioni della cromatina. Studi di singola molecola come microscopia a forza atomica (AFM) imaging hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione corrente del ruolo del nucleosoma struttura e dinamica. L'attuale protocollo viene descritta la procedura di attivazione di tecniche di imaging ad alta risoluzione AFM studiare le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Il protocollo è illustrato dai dati AFM ottenuti per i nucleosomes centromero in cui istone H3 è sostituito con proteina di sua controparte centromero (CENP-A). Il protocollo inizia con l'Assemblea del mono-nucleosomi utilizzando un metodo di diluizione di continuo. La preparazione del substrato mica funzionalizzato con amminopropil silatrane (APS-mica) che viene utilizzato per l'imaging del nucleosoma è critica per la visualizzazione di AFM dei nucleosomi descritto e viene fornita la procedura per preparare il substrato. Nucleosomi depositati sulla superficie della APS-mica sono prima Imaging utilizzando statico AFM, che cattura un'istantanea della popolazione nucleosoma. Dall'analisi di queste immagini, parametri quali la dimensione del DNA avvolto intorno i nucleosomes possono essere misurate e questo processo è anche dettagliato. Il time-lapse AFM procedura nel liquido di imaging è descritto per l'alta velocità AFM time-lapse che può catturare diversi frame delle dinamiche nucleosoma al secondo. Infine, l'analisi delle dinamiche del nucleosoma consentendo la caratterizzazione quantitativa dei processi dinamici è descritta e illustrata.

Introduction

Nelle cellule eucariotiche, il DNA è altamente condensata e organizzato in cromosomi. 1 il primo livello di organizzazione del DNA all'interno di un cromosoma è l'Assemblea di nucleosomi in cui 147 bp di DNA è strettamente avvolto intorno ad un nucleo istonico istone. 2 , 3 particelle nucleosome montare su una lunga molecola di DNA che formano una matrice di cromatina che viene organizzata fino a formare un'unità estremamente compatta del cromosoma. 4 il disassemblaggio della cromatina fornisce l'accesso per liberare il DNA richiesto dalla critici processi cellulari quali la replica di genoma e trascrizione genica, suggerendo che quella della cromatina è un sistema altamente dinamico. 5 , 6 , 7 comprendere le proprietà dinamiche del DNA a vari livelli di cromatina è criticamente importante per il delucidamento processi genetici a livello molecolare, dove gli errori possono portare alla morte delle cellule o lo sviluppo di malattie come il cancro. 8 una proprietà della cromatina di grande importanza è la dinamica dei nucleosomi. 9 , 10 , 11 , 12 l'alta stabilità di queste particelle ha permesso per la caratterizzazione strutturale mediante tecniche cristallografiche. 2 quali mancanza di questi studi sono unwrapping dal nucleo dell'istone; i dettagli dinamici di nucleosomi come il meccanismo del DNA il percorso dinamico di cui è necessario per i processi di trascrizione e replicazione. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 inoltre, speciali proteine chiamate fattori di rimodellamento sono stati indicati per facilitare lo smontaggio di particelle nucleosomal17; Tuttavia, la dinamica intrinseca dei nucleosomi è il fattore critico in questo processo che contribuisce al processo intero smontaggio. 14 , 16 , 18 , 19

Tecniche di singola molecola come singola molecola fluorescenza19,20,21, intrappolamento ottico (pinzette)13,18,22,23 e AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 sono stati strumentale nella comprensione delle dinamiche di nucleosomi. Tra questi metodi, AFM beneficia di diverse caratteristiche uniche e interessanti. AFM permette di visualizzare e caratterizzare singoli nucleosomi, nonché il più lungo di matrici27. Dalle immagini AFM, caratteristiche importanti della struttura del nucleosoma ad esempio la lunghezza del DNA avvolto intorno al nucleo dell'istone possono essere misurati 10,14,26,28; un parametro fondamentale per la caratterizzazione della dinamica unwrapping nucleosoma. Passato AFM studi hanno rivelato nucleosomi per essere sistemi altamente dinamici e che il DNA può spontaneamente unwrap dal nucleo dell'istone14. L'unwrapping spontanea del DNA da nucleosomi direttamente è stato visualizzato da AFM di funzionamento in modalità Time-lapse quando l'imaging avviene in soluzioni acquose 14,26,29.

L'avvento della strumentazione ad alta velocità Time-lapse AFM (HS-AFM) ha permesso di visualizzare il processo unwrapping nucleosoma al millisecondo scala tempo 14,15,24. Recenti studi di30 16,HS-AFM di nucleosomi specifico centromero ha rivelato parecchie caratteristiche romanzo dei nucleosomes rispetto al tipo canonico. Nucleosomi centromero si costituiscono di un centromero, una piccola parte del cromosoma criticamente importante per cromosoma segregazione31. A differenza dei nucleosomi canonici nella cromatina di massa, il nucleo dell'istone di nucleosomi centromero contiene istone CENP-A invece di istone H332,33. A seguito di questa sostituzione dell'istone, avvolgimento del DNA in nucleosomi centromero è ~ 120 bp invece la 147 ~ bp per canoniche nucleosomi; una differenza che può portare a diverse morfologie del centromero e canonici nucleosomi matrici34, suggerendo che cromatina centromero subisce dinamica superiore confrontato con la maggior parte uno. La dinamica romanzo visualizzata da nucleosomi centromero negli studi di30 16,HS-AFM esemplificano l'opportunità unica fornita da questa tecnica di singola molecola di visualizzare direttamente le proprietà strutturali e dinamiche di nucleosomi. Esempi di queste funzionalità saranno brevemente discusso e illustrati alla fine del libro. Questo progresso è stato effettuato a causa dello sviluppo di nuovi protocolli per formazione immagine AFM di nucleosomi, nonché le modifiche dei metodi esistenti. L'obiettivo del protocollo descritto qui è di rendere questi entusiasmanti progressi negli studi di singola molecola AFM nucleosoma accessibile a chiunque abbia voglia di utilizzare queste tecniche nelle loro indagini della cromatina. Molte delle tecniche descritte sono applicabili a problemi oltre lo studio dei nucleosomi e può essere utilizzati per indagini di altre proteine e DNA sistemi di interesse. Alcuni esempi di tali applicazioni possono essere trovati in pubblicazioni35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 e prospettive di AFM studi di vari sistemi biomolecolari sono date in recensioni29,50,51,53,54.

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Protocol

1. continuo diluizione Assemblea del Mono-nucleosomi

  1. Generare e purificare un substrato di DNA bp circa 400 che contiene un decentrato Widom 601 nucleosoma sequenza di posizionamento. 55
    Nota: Per limitare la formazione indesiderata di-nucleosomi, ogni 'braccio' che fiancheggiano la sequenza di posizionamento non deve superare ~ 150 bp.
    1. Utilizzare il plasmide pGEM3Z-601 insieme con gli iniettori progettati e amplificare il DNA substrato usando la PCR. Per il substrato 423 bp con lunghezze di braccio di 122 e 154 bp usato qui, utilizzare avanti (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') e inversa (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') primer.
    2. Aggiungere le provette contenenti la miscela di reazione di un termociclatore preriscaldato a 95 ° C. Eseguire il seguente programma per 33 cicli dopo una denaturazione iniziale per 5 min a 95 ° c: 30 s denaturazione a 95 ° C, 30 s ricottura a 49 ° C, 35 estensione s a 72 ° C. Impostare un'estensione finale a 72 ° C per 10 min seguendo i cicli di 33.
    3. Purificare il DNA dalla miscela PCR utilizzando un Kit di purificazione di PCR commercialmente disponibile. Quando eluizione del DNA dalla colonna di pulizia PCR, utilizzare tampone Tris 10 mM (pH 7,5) al posto del kit fornito tampone di eluizione.
      Nota: Prestare particolare attenzione non al buffer di trasferimento tra le fasi di purificazione. Un eluente contaminata può causare problemi a valle quando misura la concentrazione di DNA e/o può alterare la concentrazione di sale partenza della miscela Assemblea nucleosoma.
  2. Determinare la concentrazione di DNA misurando l'assorbanza del DNA purificato a 260 nm.
    1. Raccogliere un vuoto su UV VIS spettrofotometro utilizzando solo il buffer di eluizione 7.5 per 10 mM Tris pH. Raccogliere una misurazione del DNA purificato.
  3. Con la concentrazione determinata, aliquota 25 pmol del DNA purificato in una provetta di microfuge 0,6 mL e posizionarlo in una centrifuga vuoto fino a quando la soluzione è a malapena visibile; si tratta in genere di 30 min a 1 h.
    Nota: Il substrato di DNA è ora pronto per l'assemblaggio del nucleosoma. In caso contrario, il protocollo può essere messo in pausa qui e il DNA conservato a-20 ° C fino all'utilizzo.
  4. Collocare la provetta microfuge contenente il 25 pmol DNA sul ghiaccio e aggiungere i componenti di assemblaggio del nucleosoma in tabella 1, nell'ordine indicato. Quando tutti i componenti sono stati aggiunti, togliere il composto dal ghiaccio e incubare a temperatura ambiente (TA) per 30 min.
    Nota: È fondamentale che il contenuto di sale del buffer stock istone è considerato quando il NaCl di calcolo necessari per ottenere la concentrazione finale di 2 M. 15 , 56
  5. Assemblare i nucleosomes riducendo la concentrazione di sale 2 M della miscela a 200 mM utilizzando una diluizione di tasso di continuo. 57
    1. Riempire una siringa con 100 µ l di tampone di diluizione contenente Tris 10 mM pH 7.5 e posizionarlo su una pompa a siringa.
    2. Diretto l'ago della siringa attraverso un foro pre-forato nel tappo del tubo microfuge, assicurando un contatto è fatto con la miscela di montaggio (Figura 1).
    3. Eseguire la pompa a siringa ad un tasso di 0,75 µ l/min per 120 min.
      Nota: La risultante 100 µ l di soluzione contiene 250 nucleosomi nM e 200 mM NaCl.
    4. Trasferire il composto in un pulsante di dialisi MWCO 10K e Dializzare contro 200 mL di un tampone salino basso di pre-freddo (4 ° C) contenente Tris 10 mM pH 7.5, EDTA di 0,25 mM e 2,5 mM NaCl, 1 ora a 4 ° C.
  6. Per valutare il contenuto di istone dell'Assemblea nucleosoma, preparare un gel di SDS-PAGE discontinuo con un 15% che separa e 6% accatastamento come descritto in precedenza30.
    1. Aliquotare 10-20 µ l del nucleosoma stock ad un tubo di microfuge e aggiungere 4 x Laemmli Buffer del campione ad una concentrazione di lavoro di 1-2 x. 58
    2. Come controllo, ripetere questa preparazione in un tubo separato microfuge per 1-2 µ g dello stock dell'istone. Riscaldare i campioni a 95 ° C per ~ 5 min.
    3. Caricare i campioni nelle corsie adiacenti uno a altro sul gel. Aggiungere tampone del campione per i vicoli non utilizzati per promuovere la migrazione anche band.
    4. Esegua il gel a 65 V fino a quando la parte anteriore del colorante si muove attraverso il gel d'impilamento. Quando viene raggiunto il gel di separazione, aumentare a 150 V ed eseguire fino a quando la parte anteriore della tintura ha varcato completamente il gel.
    5. Smontare l'unità di elettroforesi e delicatamente trasferisca il gel ad un colorazione contenitore riempito con dd H2O. Lasciate il gel riposare per 5 minuti con agitazione delicata. Ripetere questo processo due volte più con dd fresco H2O usato ogni volta.
      Nota: La macchia di Coomassie utilizzata nel presente protocollo non richiede i passaggi tipici di fissaggio necessari per le macchie di Coomassie (Vedi Tabella materiali). Se viene utilizzata un'altra preparazione di Coomassie, regolare le operazioni di fissaggio.
    6. Rimuovere l'acqua dal risciacquo finale e aggiungere appena sufficiente macchia per coprire il gel. Sieda il gel con movimentazione delicata per almeno 1 h.
      Nota: Per l'agitazione, il contenitore di colorazione può essere collocato su qualsiasi apparato che promuove il movimento della macchia sopra il gel, anche mantenendo il gel coperto in liquido.
    7. Rimuovere la macchia dal contenitore e risciacquare il gel con dd H2O. sostituire il dd H2O e immergere il gel per 30 min con agitazione delicata. (Il gel dovrebbe apparire come quello illustrato nella Figura 2, con la netta separazione delle bande dell'istone).
  7. Memorizzare i nucleosomes a 4 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Se conservati in queste condizioni, nucleosomi rimangono stabili per diversi mesi. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

2. funzionalizzazione della superficie di Mica per l'Imaging AFM statico dei nucleosomi

  1. Preparare una soluzione 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS stock in acqua deionizzata come descritto. Aliquote a 30 store 1 mL di questa soluzione a 4 ° C fino all'utilizzo.
    Nota: Le aliquote possono essere conservate per più di un anno a 4 ° C. 59
  2. Preparare una soluzione di 1: 300 APS di lavoro per la modifica di mica sciogliendo 50 µ l dello stock APS 50 mM in 15 mL dd H2O.
    Nota: Questa soluzione di lavoro può essere conservata a temperatura ambiente per diversi giorni.
  3. Tagliare le strisce di 1 x 3 cm di mica da fogli di mica di alta qualità (Vedi Tabella materiali per mica usato qui).
    1. Controllare che il pezzo si inserisce quando posizionati in diagonale in una cuvetta. Usare la punta di pinzette taglienti, una lama di rasoio o nastro adesivo, per fendere strati della mica fino a quando entrambi i lati sono appena spaccati e il pezzo è sottile come ~0.1 mm (Figura 3A). Immediatamente posto il pezzo mica nella cuvetta APS riempito e incubare per 30 min (Figura 3B).
  4. Trasferire il pezzo mica una cuvetta riempita con dd H2O e ammollo per 30 s (Figura 3). Asciugare completamente entrambi i lati della striscia APS-mica sotto un flusso di argon.
    Nota: Un tessuto non tessuto cellulosa e poliestere cleanroom wipe (consigliato pulire dettagliate nei materiali) può essere utilizzati per facilitare la traspirazione dell'acqua dal bordo della mica durante l'asciugatura.
  5. Utilizzare il nastro di mica asciutto è ora per la preparazione del campione. In caso contrario, è possibile memorizzare il pezzo in una cuvetta pulita e asciutta (Figura 3D).
    Nota: Ulteriore spazio di archiviazione in un vuoto per 1-2 h è consigliabile quando l'ambiente è umido. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

3. preparazione dei campioni Nucleosome su APS-Mica per l'Imaging AFM statico

  1. Applicare il nastro biadesivo per diversi dischi magnetici e metterli al lato.
  2. Tagliare il substrato APS-mica fino alla dimensione desiderata (quadrati di 1 x 1 cm per lo strumento AFM MM utilizzato qui). Mettere questi pezzi in una capsula Petri pulita e tenere coperto.
  3. Preparare tre diluizioni dei nucleosomes assemblati (finale nucleosoma concentrazioni di 0.5, 1.0 e 2.0 nM) utilizzando un 0,22 µm filtrata tampone contenente 10 mM HEPES pH 7.5 e 4 mM MgCl2.
    Nota: Per limitare la perdita di nucleosomi presso la bassa concentrazione finale, le diluizioni dovrebbero essere fatto uno alla volta, immediatamente prima della deposizione su APS-mica.
  4. 5-10 µ l del campione diluito nucleosoma di deposito presso il centro del pezzo APS-mica e lasciare Incubare per due minuti. Sciacquare delicatamente il campione con 2-3 mL di dd H2O per rimuovere tutti i componenti di buffer. Dopo ogni mL di ~0.5 di dd H2O utilizzato, agitare delicatamente la mica per rimuovere l'acqua in eccesso.
    Nota: Si raccomanda una siringa monouso per questa fase di risciacquo.
  5. Essiccare il campione depositato sotto un leggero flusso di gas argon pulito.
    Nota: Il campione è pronto per essere imaged o possa essere memorizzato in un armadietto vuoto o un essiccatore riempito con argon. Campioni preparati e conservati come descritto sono stato ripreso un anno dopo la preparazione senza perdita di qualità. Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. statico AFM Imaging dei nucleosomi

  1. Montare una punta AFM sul supporto della punta. Utilizzare una punta che ha una costante di primavera di ~ 40 N/m e una frequenza di risonanza tra 300 e 340 kHz (Vedi la Tabella materiali per il cantilever usato qui).
  2. Montare il campione preparato nella sezione 3 sul palco AFM facendo attenzione a non entrare in contatto la superficie del campione.
  3. Posizionare il laser sopra la trave a mensola fino a quando la somma è al massimo e regolare i valori di deflessione verticale e laterale per quasi a zero.
  4. Sintonizzare la sonda AFM per trovare la propria frequenza di risonanza e regolare l'ampiezza del disco e impostare le dimensioni dell'immagine a 100 x 100 nm. Fare clic sul pulsante impegnare per iniziare l'approccio.
  5. Una volta che si avvicinava, ottimizzare gradualmente il Setpoint di ampiezza fino a quando la superficie del campione è chiaramente visibile. Aumentare la dimensione di scansione a 1 x 1 µm e la risoluzione di 512 x 512 pixel. Fare clic sul pulsante cattura seguito dal pulsante impegnare per iniziare l'acquisizione di immagini.
    Nota: Le immagini nella Figura 4 mostrano lo sfondo liscio che può essere previsto quando questi campioni di imaging.
  6. Per analizzare il campione nucleosoma, aprire le immagini acquisite utilizzando il software di analisi di strumenti AFM.
    1. Appiattire l'immagine utilizzando una linea polinomiale sottrazione o funzionalità simili.
    2. Impostare la tabella dei colori per riflettere il valore minimo per il minimo e il valore più alto per massimo. Tenere un registro di questi valori per ogni immagine come saranno necessari in un passaggio successivo.
      Nota: Se questi valori non vengono utilizzati, i dati di altezza sarà corretti in analisi successive come sezioni trasversali di core nucleosoma apparirà come altipiani di altezza uguale, piuttosto che varia.
    3. Esportare l'immagine come TIFF immagine alle dimensioni originali. De-selezionare le opzioni per salvare l'immagine con un bordo o scala bar.
    4. Aprire l'immagine nel software di analisi capace di misurazioni di lunghezza contorno.
    5. Impostare x, y e z scale per abbinare l'immagine.
    6. Come una calibrazione lunghezza interna, misurare e registrare la lunghezza del contorno di DNA libero da un'estremità a altra. Per questo fattore di taratura, è necessario utilizzare le misure per generare un istogramma e montarla con una distribuzione normale (gaussiana). Dividere il centro di picco (xc) per la lunghezza di substrato in coppie di basi.
      Nota: Questo valore è il fattore di immagine specifico conversione da nanometri a coppie di base del DNA.
    7. Misurare e registrare la lunghezza del contorno di entrambe le braccia per ogni nucleosoma dall'estremità libera del braccio al centro del nucleo, per coerenza (Figura 5A).
    8. Per ciascun core del nucleosoma, raccogliere due full larghezza a metà massimi valori (FWHM) da una coppia perpendicolare del nucleo misure di sezioni trasversali (figura 5B media delle due misurazioni di FWHM e sottrarre la metà del valore risultante da ciascun braccio nucleosoma a corretto per la lunghezza misurata dall'uscita/entrata del DNA al centro del nucleo che non fa parte della lunghezza del braccio.
    9. Dividere ogni lunghezza di braccio per il fattore di calibrazione calcolata (passo 4.5.6) per ottenere lunghezze del braccio in coppie di basi del DNA.
    10. Calcolare la misura del DNA avvolgimento sottraendo la somma di braccio nucleosoma dalla lunghezza totale coppia di basi del substrato non imbustato. Tracciare questi valori come un istogramma e forma il peak(s) con una distribuzione normale (gaussiana) per ottenere la medie avvolte paia di basi del DNA per la popolazione di nucleosomi.
    11. Calcolare l'altezza media nucleosoma da sezioni trasversali misurate. Tracciare questo come un istogramma e forma il peak(s) con una distribuzione normale (gaussiana) per ottenere l'altezza della popolazione nucleosoma.

5. la formazione immagine AFM time-lapse del nucleosoma Dynamics

  1. Montare la punta AFM sul supporto della punta. Può essere utilizzata una sonda con una molla di costante di circa 0.1 N/m e una frequenza di risonanza di 7-10 kHz (vedere la lista di materiali per il cantilever usato qui).
  2. Fissare un pezzo di 1 x 1 cm di APS-mica per un disco magnetico con biadesivo e montare il puck sullo strumento AFM.
  3. Diluire i nucleosomes ad una concentrazione di 1 nM in un buffer di formazione immagine filtrata da 0,22 µm contenenti 10 mM HEPES pH 7.5 e 4 mM MgCl2.
  4. Deposito 5-10 µ l del nucleosoma diluito al centro del pezzo mica per 2 min risciacquo il campione depositato con 20 µ l di buffer di imaging due volte. Dopo il secondo risciacquo, mantenere una goccia di tampone sulla superficie di imaging.
  5. Utilizzare la fotocamera vista dall'alto per trovare la punta e l'approccio alla superficie manualmente fino a quando la punta è ~ 100-500 µm dalla superficie.
  6. Aggiungere ulteriori buffer imaging per colmare il divario tra la punta e la superficie. In questo esempio, circa 50 µ l di tampone imaging è sufficiente a colmare la lacuna. Trovare un picco di risonanza per la punta.
  7. Iniziare l'approccio computerizzato alla superficie. Quando si avvicinò, iniziare la formazione immagine con un'area di 1-2 µm per selezionare un'area di nm ~ 500 di interesse. Con questa area di interesse selezionata, regolare la densità di acquisizione dati a 512 x 512 pixel.
  8. Regolare la tensione del set-point e guidare i parametri di ampiezza per migliorare la qualità dell'immagine. Un'ampiezza libera di 10 nm o meno e una velocità di scansione di ~ 2 Hz può essere utilizzata per catturare immagini di qualità. Nella Figura 6è riportato un esempio delle dinamiche nucleosoma acquisiti mediante AFM time-lapse.

6. alta velocità Time-lapse AFM Imaging del nucleosoma Dynamics

Nota: Il protocollo sottostante viene fornito per lo strumento di HS-AFM sviluppato dal gruppo Ando (Università di Kanazawa, Kanazawa, Giappone). 60

  1. Preparare APS-mica per l'imaging liquido.
    1. Fissare la bacchetta di vetro alla fase dello scanner AFM utilizzando la bacchetta di vetro - colla dello scanner (Vedi Tabella materiali). Lasciare che questo secco per un minimo di 10 min.
    2. Rendere ~0.1 mm spessore circolare pezzi di mica con un diametro di 1,5 mm di punzonatura loro da una grande lastra di mica. Utilizzare la colla di canna di vetro mica HS-AFM (Vedi Tabella materiali) per collegare questo pezzo di mica per la bacchetta di vetro sulla HS-AFM e a secco, intatta per un minimo di 10 minuti. Cleave strati utilizzando un nastro sensibile alla pressione, fino a quando uno strato ben fenduto è visto sul nastro.
    3. Diluire 1 µ l di brodo APS 50 mM in 99 µ l di dd H2O per ottenere una soluzione APS 500 µM. Deposito 2,5 µ l di questa soluzione sulla superficie appena fenduti mica e lasciate funzionalizzare per 30 min.
      Nota: Per evitare l'essiccazione della superficie mentre funzionalizzazione, il tappo di una provetta conica per centrifuga da 50 mL può essere in forma con un umido pezzo di carta da filtro e posizionato sopra lo scanner. Lo stock APS è diluito 3 volte meno per l'imaging liquido rispetto per imaging statico per controllare le dinamiche con una frequenza che può essere osservata con AFM.
    4. Sciacquare la mica con 20 µ l di dd H2O applicando diversi risciacqui di ~ 3 µ l. Rimuovere l'acqua completamente dopo ogni risciacquo mettendo un panno di tessuto non tessuto al bordo della mica. Dopo il risciacquo finale, mettere ~ 3 µ l di dd H2O sulla superficie e lasciare riposare per un minimo di 5 min per rimuovere qualsiasi APS non specifico associato.
  2. Posizionare la sonda nel supporto HS-AFM e posizionare il supporto sul palco AFM con la punta rivolta verso l'alto. Sciacquare il titolare utilizzando ~ 100 µ l di dd H2O seguito da risciacqui due ~ 100 µ l di 0,22 µm filtrata nucleosomi imaging del buffer che contiene 10 mM HEPES pH 7.5 e 4 mM MgCl2.
  3. Con i risciacqui fatto, riempire la camera con ~ 100 µ l del nucleosoma buffer, sommergendo la punta di imaging. Regolare la posizione a sbalzo fino a quando non viene colpito con il laser. Sciacquare la APS-mica con 20 µ l di filtrato nucleosoma buffer, di imaging utilizzando ~ 4 µ l per risciacquo.
  4. Diluire 1 µ l dello stock di assemblaggio del nucleosoma in 250 µ l di filtrato nucleosoma imaging buffer per una concentrazione finale nucleosoma di 1 nM. 2,5 µ l di questa diluizione di depositarsi sulla superficie e lasciare riposare per 2 min. Risciacquare la superficie con ~ 4 µ l di nucleosomi imaging buffer due volte. Dopo il risciacquo finale, lasciare la superficie coperta in buffer di imaging.
    Nota: Se la superficie non viene risciacquata dopo aver depositato il campione nucleosoma, la superficie rapidamente diventa affollata.
  5. Impostare lo scanner e il campione sopra il titolare di punta in modo che il campione è volto verso il basso. Per iniziare l'approccio, è possibile utilizzare la funzione di auto-approccio con un'ampiezza di set-point, uns vicino l'oscillazione libera ampiezza A0.
    Nota: Idealmente, unas = 0,95 un0, tuttavia, operativo al 82% di0 funzionerà anche se state attenti.
  6. Regolare il set point fino a quando la superficie è ben monitorata.
    Nota: Per ridurre al minimo il trasferimento di energia dalla punta AFM al campione nucleosoma, mantengono l'ampiezza dello sbalzo deve essere piccolo, con ampiezze basse quanto 1 nm ottimale.
  7. Impostare l'area di immagine circa 150 x 150 nm a 200 x 200 nm con velocità di acquisizione dati di ~ 300 ms per ogni fotogramma di imaging.
    Nota: Questa dimensione dell'immagine è in genere sufficiente per catturare le dinamiche dei nucleosomi diversi contemporaneamente. Una superficie meno popolata può richiedere modifiche a questi parametri. La frequenza fotogrammi suggerito è sufficiente a catturare nucleosoma dinamiche come loop, scorrevole e scartare, tra gli altri (Vedi sezione rappresentante risultati di sotto).

7. analisi delle dinamiche di Nucleosome acquisiti mediante AFM time-lapse

  1. Convertire le immagini dal tipo di dati di HS AFM (ASD) in immagini TIFF.
    1. Appiattire le immagini utilizzando software di analisi del sistema AFM con funzioni sia in aereo o in linea fino a quando lo sfondo è uniforme di contrasto.
    2. Impostare il contrasto dell'immagine (scala di colore) su automatico.
      Nota: Il contrasto può essere regolato manualmente per scopi di presentazione, ma non per l'analisi. In questo modo dettaglio di altezza per essere perso nelle immagini convertite.
    3. Salvare l'intervallo selezionato di immagini come un file con estensione MOV. Deseleziona la barra della scala e bordo opzioni prima di salvare.
      Note: Non fare analisi sulle immagini che contengono le barre di scala nel telaio. Questi modificare le dimensioni dell'immagine e si tradurrà in false misurazioni.
    4. Convertire il file. MOV in immagini tiff utilizzando un software adatto (Vedi Tabella materiali). Utilizzare lo stesso frame rate per la conversione è stato utilizzato quando si crea il file. MOV.
  2. Per misurazioni contorno di lunghezza del braccio, aprire le immagini in un software di misurazione capace di questa misura tipo (Vedi Tabella materiali).
    1. Impostare le dimensioni dell'immagine affinché corrispondano a quelle in cui è stato catturato.
    2. Misurare la lunghezza del contorno di ogni braccio nucleosoma dall'estremità del braccio al centro del nucleo nucleosoma e registrare le misurazioni in un foglio di calcolo (Figura 4A).
    3. Misurare la lunghezza del substrato del DNA non incapsulato nei fotogrammi dopo un nucleosoma scarta. Utilizzare questa opzione per una taratura specifica film del rapporto nm/bp che è usato per nucleosoma avvolgimento calcoli
    4. Raccogliere due profili di sezioni trasversali per il nucleo di nucleosomi e due per il DNA nudo (Figura 4B).
    5. Importare i profili di sezione trasversale di un software di foglio di calcolo e normalizzare le trame sottraendo il valore più basso di z da tutti i punti nel profilo.
    6. Calcolare l'altezza e la larghezza a metà altezza (FWHM) per ogni sezione trasversale e media dei valori dei due profili per ogni fotogramma.
  3. Sottrarre la metà del valore FWHM da ciascuno del nucleosoma braccia sono trama come un grafico a dispersione con la somma calcolata delle braccia.
    1. Calcolare la lunghezza media di contorno da misurazioni del DNA effettuate per il DNA in fotogrammi dopo il nucleosoma scartato.
    2. Determinare il fattore di calibrazione nm/bp dividendo la lunghezza media di contorno del DNA libero dalla lunghezza del substrato DNA base pair. Utilizzare questo valore per calcolare avvolgimento nucleosoma in ogni fotogramma, come descritto nella sezione 5.12.

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Representative Results

Mono-nucleosomi sono stati preparati prima per AFM imaging esperimenti utilizzando un metodo di assemblaggio di continuo diluizione (Figura 1). I nucleosomes preparati erano poi controllati mediante SDS-PAGE discontinua (Figura 2). Una superficie di mica era successiva funzionalizzata con APS, che cattura nucleosomi alla superficie pur mantenendo un fondo liscio per imaging ad alta risoluzione (Figura 3). Nucleosomi sono stati depositati su APS-mica e successivamente erano imaged usando la formazione immagine AFM statica. Come controllo per il montaggio e la deposizione, H3 mono-nucleosomi sono stati preparati e imaging utilizzando statico AFM. Un'immagine di mono l'H3-nucleosomi (Figura 4A) fornisce un'istantanea della popolazione nucleosoma, così come si presentava momenti prima deposizione, confermando che nucleosomi sono stati assemblati correttamente. La deposizione di nucleosomi nM 2 fornito una distribuzione uniforme del nucleosoma e particelle di DNA su tutta la superficie e molto poco a nessun affollamento è stata osservata.

Con il gruppo di controllo H3 un successo, i metodi presentati successivamente sono stati applicati allo studio dei nucleosomi CENP-A. La formazione immagine AFM statica di questo esempio (Figura 4B) ha rivelato che l'assembly è stato un successo. Per dimostrare l'influenza della concentrazione del nucleosoma sulla densità della superficie delle particelle, i nucleosomes CENP-A sono stati depositati a 1 nM (Figura 4B), rispetto ai 2 nM utilizzato per H3 (Figura 4A). Ciò ha provocato una densità ridotta superficie della particella per il campione di CENP-A circa la metà che di H3 campione. Dalle immagini statiche di AFM, l'altezza e Disabilita il numero di mono-nucleosomi sono stato caratterizzato (Figura 5). Sia l'angolo tra le braccia di DNA libera e la lunghezza delle braccia del DNA libera è stato utilizzato per determinare che il numero di DNA si trasforma nel nucleosoma individuo.

Time-lapse immagini AFM dei nucleosomes nel buffer è stato usato per prevedere il comportamento nel complesso spontaneo unwrapping di nucleosomi (Figura 6). Misura l'angolo tra le braccia nucleosoma e la lunghezza del contorno delle braccia consentito per il numero di turno da determinarsi in ogni fotogramma durante questo processo unwrapping (Figura 6 B-C). Man mano che diminuisce il numero di turno del nucleosoma, una corrispondente diminuzione del volume del nucleo nucleosoma è anche osservata (Figura 6). AFM time-lapse ad alta velocità è stato utilizzato successivamente per sondare le più intricate dinamiche nucleosoma che sono state mancate usando formazione immagine standard time-lapse. La capacità di questa tecnica di catturare le dinamiche per un lungo periodo di tempo è stato essenziale per la visualizzazione di uno spostamento a lunga percorrenza di un nucleo di CENP-A nucleosoma (Figura 7) che è stato catturato nel corso di ~ 1200 telai. Questa tecnica è stato anche critica nel catturare il raro trasferimento di un nucleo di CENP-A nucleosoma da un substrato di DNA a un'altra (Figura 8). Il tasso di cattura di immagini veloce (~ 300 ms/frame) permessa la visualizzazione di questo evento dinamico, come ci sono voluti diversi fotogrammi per completare.

Tabella 1: i reagenti necessari per il montaggio di continuo sale gradiente nucleosoma. Ognuno dei componenti elencati viene aggiunto al tubo microfuge contenente il DNA purificato. Questo dovrebbe essere fatto nell'ordine in cui i reagenti sono elencati nella tabella, con acqua e NaCl aggiunto per primo, seguito dal dimero H2A/H2B e il tetramero di istone aggiunto per ultimo. Se pre-piegati istone octamers devono essere utilizzati, aggiungere a parità di rapporto per quanto riguarda il tetramero sopra. * Prendere nota del NaCl contenuto in ciascuno degli stock dell'istone e regolare i 5 M di NaCl per aggiungere di conseguenza, la finale [NaCl] deve essere uguale a 2M.  (Vedi tabella dei materiali).

Figure 1
Figura 1: Schematica della pompa siringa utilizzata per l'assemblaggio di Microscala nucleosoma. La miscela di assemblaggio è posizionata per essere a contatto con la fine dell'ago della siringa. Come la diluizione buffer è fornita dalla pompa siringa alla miscela di assemblaggio che è diminuita la concentrazione di NaCl, promuovendo Assemblea nucleosoma. Questa figura è adattata da Stumme-Diers et al. 30 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: SDS-PAGE di assemblati nucleosomi. Corsie 1 e 2 contengono l'istonico H3 e l'Assemblea di CENP-A degli istoni, rispettivamente. Corsie 3 e 4 contengono i nucleosomes H3 assemblati e i nucleosomes assemblati di CENP-A, rispettivamente. Confronto tra i nucleosomes assemblati per i controlli solo istone in corsie, confermare che nucleosomi sono stati assemblati correttamente. Lo schema del fumetto sopra ogni corsia indica quali componenti dell'istone sono presenti. Questa figura è adattata da Stumme-Diers et al. 30 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: schema del processo per preparare APS funzionalizzati mica per formazione immagine AFM di nucleosomi. (A) un pezzo di mica ~0.1 mm in spessore ha entrambi i lati appena spaccati. (B) il pezzo fenduti mica è tempestivamente messi in diagonale in una provetta contenente la soluzione APS ed è impostato su Incubare per 30 min (C) passaggio di funzionalizzazione seguente the APS, il pezzo di APS-mica viene trasferito a una provetta riempita con dd H2 O per un risciacquo s 30. (D), la APS-mica è memorizzata in una cuvetta fino all'utilizzo.   Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: esempio AFM immagini di H3 e nucleosomi CNEP-A. (A) immagine di esempio di H3 mono-nucleosomi depositato su APS-mica, acquisita mediante AFM statico. Ogni luminoso blob è una particella nucleosome con le regioni di DNA fiancheggianti apparendo come noodle-come le armi. Il lungo noodle-come le caratteristiche sono particelle libere di DNA che non sono associate con un nucleo di istone. Per questa immagine, una concentrazione di nucleosomi nM 2 è stato utilizzato, fornendo una distribuzione uniforme su tutta la superficie, con poco o nessun affollamento. (B), in questo esempio nucleosoma è stato depositato a 1 nM ed è molto meno popolata rispetto alle 2 nM utilizzato in (A). Ciò dimostra l'effetto diretto che diluizione nucleosoma ha sulla densità della superficie dei nucleosomi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: rappresentazione grafica dell'analisi utilizzata per caratterizzare l'avvolgimento e l'altezza delle particelle nucleosoma. (A), A particella nucleosome rappresentativo dalle immagini come quelle mostrate nella figura 3. La lunghezza del contorno di ogni braccio nucleosoma è misurata dall'estremità del braccio al centro del nucleo (linee verde punteggiate).  Stampa profili a sezione trasversale (linee rossa e blue) di un nucleosoma produrre le curve illustrate in (B) da queste curve, altezza e dettaglio di larghezza della particella può essere determinato.  (C) schema dei vari avvolto stati dei nucleosomes. (D), ciascuno stato avvolto è caratterizzato tramite l'angolo tra le braccia di DNA, il numero di giri del DNA e la bp di DNA avvolto. Barra della scala = 20 nm. Questa figura è adattata da Ljubčenko et al. 24 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Nella figura 6. Immagini di esempio di time-lapse AFM catturando il wrapping spontanea di nucleosomi. (A), A serie di immagini AFM consecutive del processo spontaneo unwrapping di nucleosomi catturato dalla scansione continua nel buffer. La dimensione di ogni fotogramma è 200 nm e immagini sono stati catturati a un tasso di ~ 170 s per fotogramma. (B) come il processo unwrapping progredisce in ogni fotogramma, le lunghezze di braccio dell'aumento nucleosoma, (C) conseguente a una diminuzione nel DNA gira il nucleosoma. Questo numero di turno può essere determinato dalle lunghezze di braccio misurato (nere) o l'angolo tra le braccia del nucleosoma (rosso). Man mano che diminuisce il numero di turno, una riduzione del volume del nucleosoma inoltre è osservato (curva blu, asse destro). Ogni fotogramma è di 200 x 200 nm in dimensione. Questa figura è adattata da Ljubčenko et al. 24 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7. Dimostrazione della elevata capacità di AFM time-lapse ad alta velocità per tempi di acquisizione immagine lunga (A), A Galleria di immagini da più di 1200 telai che dimostra il comportamento di spostamento di un nucleo di CENP-A nucleosomi. Ogni immagine è stata catturata ad un tasso di ~ 300 ms/telaio. (B) misure di lunghezza di contorno da un'estremità del substrato del DNA al nucleo CENP-A sono utilizzate per caratterizzare questo processo di traslocazione lungo. Barra della scala = 25 nm. Questa figura è adattata da Stumme-Diers et al. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8. Esempio di un trasferimento di nucleo dinamico nucleosoma acquisito mediante AFM time-lapse ad alta velocità (figura adattata da Stumme-Diers et al. 16 (A) i fotogrammi selezionati dimostrando il trasferimento spontaneo di un nucleo di CENP-A nucleosoma da un substrato di DNA a altra. Questo processo ha avuto luogo all'interno di parecchie strutture che furono catturati a una velocità di ~ 300 ms/telaio. (B) un disegno schematico del processo di trasferimento mostrato in (A). Barra della scala = 25 nm. Questa figura è adattata da Stumme-Diers et al. 16 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo descritto sopra è piuttosto semplice e fornire risultati altamente riproducibili, anche se alcuni problemi importanti possono essere enfatizzati. Funzionalizzati APS-mica è un substrato fondamentale per ottenere risultati affidabili e riproducibili. Un'elevata stabilità di APS-mica è una delle caratteristiche importanti di questo substrato che permette di preparare il substrato imaging in anticipo per l'uso che può essere utilizzato almeno due settimane dopo la fase di preparazione. 59 , 61 tuttavia, la superficie può essere danneggiata dai vapori di colla se viene utilizzato per montaggio sul puck metallo mica. Pertanto, si consiglia di utilizzare nastro doppio bastone per la mica di montaggio come descritto nel protocollo (sezione 2). Nei casi quando è necessario, l'uso di colla, ad esempio, alcuni utenti utilizzano colle per il montaggio di mica su dischi di metallo per l'imaging in liquido, la procedura seguente per volta da quella descritta nella sezione 6.1.3 per la preparazione del campione per l'imaging di HS-AFM è consigliata . Mica è incollato al disco di metallo o altro materiale solido e spaccato dopo che la colla è solidificata. Soffiare la mica con argon per rimuovere potenziali vapori della colla. Poi la mica possa essere spaccata con un nastro adesivo e la soluzione di lavoro mica APS collocati per coprire il nastro di mica appena spaccati. La quantità della soluzione dipende la dimensione dello strip mica. Consentire l'APS a reagire per 30 min. Per ridurre l'evaporazione, è necessario eseguire la reazione in una capsula Petri bagnato. Utilizzare la procedura seguente: Soak laboratorio panno carta e posto è nella parte inferiore della capsula di Petri. Posizionare un disco di plastica spessa 5mm su salviettine umidificate e mettere il disco di metallo con mica incollato su di esso evitando il contatto con acqua sul fondo del piatto Petri. Dopo 30 min, rimuovere il gruppo di mica/disco e sciacquare accuratamente la superficie di mica con dd acqua e pipetta come descritto nella sezione 6.1.3. La superficie è pronta per la deposizione del campione. La concentrazione di APS deve essere regolata in esperimenti con il DNA, anche se la soluzione APS (1: 300) descritta nella sezione 2.2 di lavoro dovrebbe essere un buon punto di partenza. Il protocollo descritto nella sezione 6.1.3 in cui viene descritta la procedura per l'imaging di nucleosomi con HS-AFM, è stata utilizzata il triplice maggiore concentrazione di APS (1: 100).

Il protocollo descritto si basa sulla funzionalizzazione di mica con APS. Questo è il più robusta, altamente riproducibile e semplice procedura. L'unico svantaggio è quello APS, amminopropil silatrane non è disponibile in commercio. Tuttavia, la procedura di sintesi APS è lineare e il protocollo per la sua sintesi è descritto in dettaglio. 59 se la procedura di sintesi è problematico, commercialmente disponibili reagenti, aminopropyltriethoxy Silano (APTES) può essere utilizzato per la funzionalizzazione di mica (AP-mica). La carta stessa fornisce il protocollo per la preparazione di AP-mica utilizzando vapori di APTES. La procedura è stata testata e utilizzata per l'imaging di topologicamente diversi tipi di DNA 35,36,50,62,63 e vari complessi proteina-DNA compreso nucleosomi. 27 , 50 , 64 Analogamente a APS-mica, AP-mica è stabile per settimane e può essere preparata in batch in anticipo; la superficie di AP-mica è liscia come APS-mica e piuttosto insensibile alla composizione di buffer, quindi i campioni possono essere preparati nelle soluzioni tampone con valori di pH fino a pH10 e punti di forza ioniche tra 1 mM e 200 mM di NaCl. 59 , 65 l'unico inconveniente con l'uso di AP-mica è la possibilità di amminopropil silani idrolizzano e assemblare in aggregati sulla superficie durante il time-lapse di imaging in acqua, anche se questo processo è piuttosto lento con le aggregazioni che possono essere distinto sulla superficie, quindi ad alta risoluzione immagini del DNA possono essere ottenute. 35 l'idrolisi della frazione di silatrane è molto lento, quindi non visibili aggregati sono visti durante la formazione immagine a lungo termine; 26 , 35 , 56 , 66 , pertanto, APS-mica è il substrato preferibile quando confrontato con AP-mica se imaging in acqua è impiegato. Per la riproducibilità utilizzando APTES, la distillazione del reagente è altamente raccomandata nella preparazione di AP-mica. Il protocollo per la distillazione di APTES è descritto nel libro 59.

AFM, come una tecnica di singola molecola, opera con nucleosoma concentrazioni presso gamma nanomolar e quello nucleosomes spontaneamente possono dissociare tali basse concentrazioni. Secondo i nostri dati 25, si verifica il processo di dissociazione in decine di minuti, suggerendo che il campione per gli studi di AFM dovrebbe essere preparato appena prima della deposizione. Alcuni detergenti come dimethylammonio 3-[(3-Cholamidopropyl)] -1-propanesulfonate (CHAPS) aumentare la stabilità del nucleosoma, così i nucleosomes aumentano la loro durata di parecchi ordini di grandezza 25, ma dovrebbe essere fatto l'uso di detergenti con cautela. Abbiamo mostrato a 25 che stabilizzazione dei nucleosomi è accompagnato dal cambiamento della specificità di sequenza, così il nucleosoma anche con l'uso di tale sequenza specifico motivo come modello di Widom 601, assemblare senza una specificità di legame per il 601 sequenza.

Ci sono una serie di questioni importanti con il metodo proposto rispetto a altri metodi di preparazione del campione AFM. In primo luogo, substrati APS-mica e AP-mica sono stabili nelle settimane e possono essere preparati in batch in anticipo; le superfici sono lisce e piuttosto insensibile alla composizione di buffer così i campioni possono essere preparati in soluzioni tampone con valori di pH fino a pH10 e punti di forza ioniche tra 1 mM e 200 mM di NaCl. 59 , 65 nessuno dei metodi esistenti corrispondono queste proprietà. In secondo luogo, AFM è una tecnica di singola molecola e richiede un campione molto poco. Il protocollo descritto funziona con importi su scala nanometrica della preparazione. In terzo luogo, negli studi di time-lapse AFM e l'acquisizione di dati HS-AFM, c'è una notevole quantità di tempo necessario per generare e caratterizzare i grandi insiemi di dati acquisiti. La metodologia descritta qui è adatta per l'analisi di centinaia di immagini AFM.

La metodologia di preparazione del campione non è limitata ai campioni tipo nucleosoma. Piuttosto è insensibile al tipo dei complessi proteina-DNA ed è già stato applicato a un numero proteine riconoscendo specifiche sequenze di DNA, ad es. restrizioni enzimi 67,68,69, DNA single-stranded associazione di proteine 44,45,56,70,71 insieme a sistemi complessi proteici coinvolti nel DNA replica 47,72 e ricombinazione68,73. D'importanza, HS-AFM è stata applicata a questi sistemi per seguire la dinamica di questi sistemi.  Questi studi consentono di applicare la metodologia sviluppata per la caratterizzazione di matrici nucleosoma come proposto nella e delucidare il ruolo di tali proteine specifiche del centromero come proteina B del centromero (CENP-B) o C (CENP-C) nell'assembly del centromero e comprendere il loro ruolo nello sviluppo di molti cancri33,34.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Autore di contributi: YLL e MSD progettato il progetto; MSD assemblati nucleosomi. MSD e ZS eseguite analisi di esperimenti e dati AFM. Tutti gli autori ha scritto e modificato il manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

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Biochimica numero 143 AFM time-lapse nucleosoma cromatina dinamica struttura istoni singolo - molecola DNA epigenetica imaging
La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio
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Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

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