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생화학

Sondando a estrutura e a dinâmica de Nucleosomes usando imagem de microscopia de força atômica

Published: January 31, 2019
doi:
10.3791/58820
, , ,
1Department of Pharmaceutical Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo de caracterização de partículas nucleossoma no nível do único-molécula usando microscopia estático e Time-Lapse de força atômica (AFM), técnicas de imagem. O método de superfície functionalization descrito permite a captura da estrutura e dinâmica dos nucleosomes em alta resolução em nanoescala.

Abstract

Cromatina, que é uma longa cadeia de subunidades nucleossoma, é um sistema dinâmico que permite tais processos críticos como replication do DNA e transcrição para tomar lugar em células eucarióticas. A dinâmica dos nucleosomes fornece acesso ao DNA por máquinas de replicação e transcrição e contribui criticamente para os mecanismos moleculares subjacentes funções de cromatina. Estudos da único-molécula como a microscopia de força atômica (AFM) imagem contribuíram significativamente para a nossa compreensão atual do papel do nucleossoma estrutura e dinâmica. O atual protocolo descreve as etapas permitindo técnicas de alta resolução de imagem AFM estudar as propriedades estruturais e dinâmicas de nucleosomes. O protocolo é ilustrado por dados AFM obtidos para os nucleosomes Centrómero na qual histona H3 é substituída com sua contraparte Centrómero de proteína (CENP-A). O protocolo começa com a montagem do mono-nucleosomes usando um método de diluição contínua. A preparação do substrato mica acrescida com aminopropil silatrane (APS-mica) que é usado para o tratamento de imagens de nucleossoma é fundamental para a visualização de AFM de nucleosomes descrito e o procedimento para preparar o substrato é fornecido. Os nucleossomas depositados na superfície de APS-mica são primeiro fotografados usando AFM estático, que capta um instantâneo da população nucleossoma. De análises destas imagens, parâmetros, tais como o tamanho do DNA enrolado os nucleosomes podem ser medidos e este processo também é detalhado. O lapso de tempo AFM de imagem procedimento no líquido é descrito para o AFM de lapso de tempo de alta velocidade que pode capturar vários quadros da dinâmica nucleossoma por segundo. Finalmente, a análise da dinâmica do nucleossoma permitindo a caracterização quantitativa dos processos dinâmicos é descrita e ilustrada.

Introduction

Em células eucariontes, o DNA é altamente condensado e organizado em cromossomos. 1 o primeiro nível de organização do DNA dentro de um cromossomo é o assembly de nucleosomes no qual 147 bp de DNA firmemente é acondicionada em torno de um núcleo de octamer de histona. 2 , 3 partículas nucleossoma montam sobre uma longa molécula de DNA, formando uma matriz de cromatina que é então organizada até uma unidade altamente compacto cromossomo é formada. 4 a desmontagem da cromatina fornece o acesso a livre DNA exigido pelo críticos processos celulares, tais como a replicação do genoma e a transcrição de genes, sugerindo que a cromatina é um sistema altamente dinâmico. 5 , 6 , 7 compreender as propriedades dinâmicas do DNA em vários níveis de cromatina é criticamente importante para elucidar os processos genéticos em nível molecular onde erros podem levar a morte celular ou o desenvolvimento de doenças como o câncer. 8 uma propriedade de cromatina de grande importância é a dinâmica dos nucleossomas. 9 , 10 , 11 , 12 a alta estabilidade destas partículas tem permitido a caracterização estrutural por técnicas cristalográficas. 2 o que a falta desses estudos são os detalhes dinâmicos de nucleosomes tais como o mecanismo do DNA desembrulhar do núcleo de histona; o percurso dinâmico de que é necessário para os processos de transcrição e replicação. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 além disso, as proteínas especiais denominadas fatores de remodelação foram mostradas para facilitar a desmontagem de partículas partícula17; no entanto, a dinâmica intrínseca da nucleosomes é o fator crítico neste processo que contribui para o processo de desmontagem inteira. 14 , 16 , 18 , 19

Único-molécula técnicas como único-molécula fluorescência19,20,21, captura óptica (pinças)13,18,22,23 e AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 ter sido instrumental na compreensão da dinâmica dos nucleosomes. Entre esses métodos, AFM beneficia de várias características originais e atraentes. AFM permite visualizar e caracterizar os nucleossomas individuais, bem como as matrizes mais27. Imagens de AFM, características importantes da estrutura do nucleossoma tais como o comprimento do DNA enrolado em torno do núcleo de histona podem ser medido 10,14,26,28; um parâmetro que é central para a caracterização da dinâmica desembrulhando nucleossoma. Passado o AFM estudos revelaram nucleosomes sistemas altamente dinâmicos e que o DNA pode espontaneamente desembrulhar o núcleo de histona14. O desempacotamento espontânea do DNA de nucleosomes foi visualizado diretamente pela AFM, operando no modo de lapso de tempo, quando a imagem é feita em soluções aquosas 14,26,29.

O advento da instrumentação AFM (HS-AFM) Time-Lapse de alta velocidade, foi possível visualizar o processo desembrulhando nucleossoma no milissegundo de tempo-escala 14,15,24. Recentes estudos de30 16,HS-AFM de específico nucleosomes Centrómero revelaram várias características inovadoras dos nucleosomes comparados com o tipo canônico. Os nucleossomas Centrómero constituem-se de um centrômero, uma pequena parte do cromossomo criticamente importante para cromossomo segregação31. Ao contrário dos nucleosomes canônicos na cromatina em massa, o núcleo de histona de nucleosomes Centrómero contém histona CENP-A em vez de histona H332,33. Como resultado desta substituição de histona, envolvimento de DNA em nucleosomes Centrómero é ~ 120 bp em vez do ~ 147 bp para nucleosomes canônicos; uma diferença que pode levar a morfologias distintas do centrómero e canônicos nucleosomes matrizes34, sugerindo que cromatina centrômero sofre maior dinâmica em comparação com o volume um. A dinâmica de novela exibida pela nucleosomes Centrómero em estudos de30 HS-AFM16,exemplificam a oportunidade única, fornecida por esta técnica de single-molécula Visualizar diretamente as propriedades estruturais e dinâmicas de nucleossomas. Exemplos desses recursos serão brevemente discutidos e ilustrados no final do livro. Este progresso foi feito devido ao desenvolvimento de novos protocolos para imagens de AFM dos nucleossomas, bem como as modificações de métodos existentes. O objetivo do protocolo descrito aqui é tornar esses avanços emocionantes em estudos de nucleossoma AFM único-molécula acessível a qualquer pessoa que gostaria de utilizar estas técnicas em suas investigações de cromatina. Muitas das técnicas descritas são aplicáveis a problemas além do estudo dos nucleosomes e podem ser usadas para investigações de outras proteínas e sistemas de DNA de interesse. Alguns exemplos de tais aplicações podem ser encontrados em publicações35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 e prospetos da estudos AFM de vários sistemas biomoleculares são dadas em clientes29,50,,51,53,54.

Protocol

1. contínua diluição Assembly de Mono-nucleosomes Gerar e purificar um substrato de DNA aproximadamente 400 bp que contém uma nucleossoma de Widom 601 fora centrado no posicionamento de sequência. 55Nota: Para limitar a formação indesejada de di-os nucleossomas, cada ‘braço’ que flanqueiam a sequência de posicionamento não deve exceder 150 ~ bp. Use o plasmídeo pGEM3Z-601, juntamente com os primers projetados e amplificar o DNA de substrato usando PCR. Para o subst…

Representative Results

Mono-nucleosomes foram preparados pela primeira vez AFM imagem experimentos usando um método de montagem de diluição contínua (Figura 1). Os nucleosomes preparados foram verificados usando descontínuo SDS-PAGE (Figura 2). Uma superfície de mica foi acrescida em seguida usando APS, que capta os nucleossomas na superfície, mantendo um fundo liso para geração de imagens de alta resolução (Figura 3). Os nucleossomas foram dep…

Discussion

O protocolo descrito acima é bastante simples e fornecer resultados altamente reprodutíveis, embora algumas questões importantes podem ser enfatizados. APS-mica funcionalizado é um substrato fundamental para obter resultados confiáveis e reprodutíveis. Uma elevada estabilidade de APS-mica é uma das características importantes deste substrato que permite preparar o substrato de imagem com antecedência para uso que pode ser usado pelo menos duas semanas depois de ser preparado. 59 ,</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Autor de contribuições: YLL e MSD desenhou o projeto; MSD reuniu os nucleossomas. MSD e ZS realizadas análises de dados e experimentos AFM. Todos os autores escreveu e editou o manuscrito.

Materials

Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan
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Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).
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