At udnytte Live Imaging til Track kerner under Myoblast differentiering og Fusion
Summary
Skeletmuskulatur differentiering er en yderst dynamisk proces, som især afhængig af nukleare positionering. Her, beskriver vi en metode til at spore kerner bevægelser af levende celle imaging under myoblast differentiering og myotube dannelse og udføre en kvantitativ karakterisering af kerner dynamics af uddrager information af automatisk sporing.
Abstract
Nukleare positionering i celler er vigtige for flere cellulære processer i udvikling og regeneration. Den mest spændende eksempel på nukleare positionering opstår under skeletmuskulatur differentiering. Muskelfibre (myofibers) er multinucleated celler dannes ved fusion af muskel forløber celler (myoblasts) stammer fra muskel stamceller (satellit celler), gennemgår spredning og differentiering. Korrekt nuklear placering inden for myofibers er nødvendig for korrekt muskel regenerering og funktion. Den fælles procedure for vurdering af myoblast differentiering og myofiber dannelse bygger på faste cellerne analyseres ved immunfluorescens, som hindrer studiet af nukleare bevægelse og celle opførsel over tid. Her, beskriver vi en metode til analyse af myoblast differentiering og myofiber dannelsen af levende celle billeddannelse. Vi leverer en software til automatiseret nukleart sporingen at opnå en høj overførselshastighed kvantitative karakterisering af nukleare dynamics og myoblast adfærd (dvs. bane) under differentiering og fusion.
Introduction
Skeletmuskulatur er den største væv i den menneskelige krop, sammentælling 35-40% af kroppens masse1. Satellit celler er muskel stamceller, anatomisk karakteriseret ved deres position (sammenstillet til plasma-membran nedenunder basal lamina af muskelfibre), som giver anledning til prolifererende myoblasts (myogenic stamceller), som i sidste ende differentiere og integrere i eksisterende myofibers og/eller smelter sammen og form nye myofibers2,3,4. Deres opdagelse og fremskridt i undersøgelsen af deres biologi har ført til betydelig indsigt i muskel udvikling og regeneration.
Protokoller til at isolere og differentiere myoblasts i myotubes er blevet udviklet for mange år siden og er stadig meget udbredt at studere skeletmuskulatur differentiering5,6,7. Men de fleste af disse metoder udgør statisk procedurer, der er afhængige af analysen af faste celler og derfor ikke tillader videnskabsfolk til fuldt ud at udforske meget dynamiske processer som myoblast fusion og myofiber modning. Det mest slående eksempel er nukleare positionering, som er stramt reguleret med kerner først i midten af myofiber og derefter placeret i periferien efter myofiber modning8,9. Live imaging er den mest hensigtsmæssige teknik til at opnå yderligere indsigt i sådan en ejendommelige fænomen.
Her, beskriver vi en metode, der gør det muligt for forskere at optage myoblast differentiering og myotube dannelse af time-lapse mikroskopi og udføre kvantitative analyser fra den automatiske sporing af myoblast kerner. Denne metode giver en høj overførselshastighed kvantitative karakterisering af nukleare dynamics og myoblast adfærd under differentiering og fusion. Protokollen er opdelt i fire forskellige dele, nemlig (1) samling af muskler fra hindlimbs af mus, (2) isolering af primære myoblasts, der består i mekaniske og enzymatiske fordøjelse, (3) myoblast spredning og differentiering og (4) Live imaging til at spore kerner inden for de første 16 h af myoblast differentiering.
I følgende procedure er myoblasts isoleret fra H2B-normal god landbrugspraksis mus og behandlet med 1 µg/mL af doxycyclin at fremkalde H2B-normal god landbrugspraksis udtryk, som tidligere beskrevet10. Alternativt er det muligt at isolere myoblasts fra andre Transgene mus, der udtrykker en fluorescerende proteiner i kernen eller transfect cellerne isoleret fra wild-type mus til at udtrykke en fluorescerende proteiner i kernen, som beskrevet af Pimentel mfl. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muskelfibre (myofibers) er multinucleated celler, der er dannet ved fusion af muskel prækursorer celler (myoblasts) stammer fra muskel stamceller (satellit celler), gennemgår spredning og differentiering2,3, 4. For at vurdere myoblast differentiering, består den fælles procedure i dyrkning af myoblasts i differentiere medium og fastsættelse af celler på forskellige tidspunkter til at udføre immunofluorescens farvning for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af AFM-Telethon at E.V. (#21545) og Ospedale San Raffaele (OSR) frø tilskud til sz (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez fra hubben billede analyse af Institut Pasteur er anerkendt for offentligt deler sin “Simple Tracker” MATLAB rutiner.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
