ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן
Summary
בידול שרירי השלד הוא תהליך דינמי מאוד, אשר נשענת בעיקר על מיקום הגרעין. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לעקוב אחר תנועות גרעינים על ידי הדמיה תא בשידור חי במהלך התמיינות myoblast היווצרות myotube וכדי לבצע אפיון כמותי של גרעינים dynamics על-ידי חילוץ מידע מעקב אוטומטי אחר.
Abstract
מיקום הגרעין בתוך התאים חשוב עבור תהליכים תאיים מרובים בהתפתחות והתחדשות. הדוגמה הכי מסקרן של מיצוב גרעיני מתרחשת במהלך התמיינות שרירי השלד. סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שהוקמה על ידי היתוך גרעיני של תאי קודמן שריר (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול. מיקום הגרעין הנכונה בתוך myofibers נדרש עבור התחדשות השרירים תקין והתפקוד. ההליך נפוצות להערכת בידול myoblast היווצרות myofiber מסתמך על תאים קבוע נותחו על ידי immunofluorescence, אשר פוגעת המחקר של תנועה גרעינית והתנהגות תא לאורך זמן. כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח של בידול myoblast היווצרות myofiber על ידי הדמיה תא חי. אנו מספקים תוכנה למעקב גרעיני אוטומטית להשיג תפוקה גבוהה אפיון כמותי של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast (קרי, את המסלול) במהלך התמיינות ופיוז’ן.
Introduction
שרירי השלד הוא הרקמה הגדולה ביותר בגוף האדם, בהיקף של 35% – 40% של מסת גוף1. תאי לוויין הם תאי גזע שריר, המאופיינת אנטומית את עמדתם (juxtaposed כדי קרום פלזמה, מתחת הנדן הבזליים של סיבי שריר), כי להצמיח myoblasts מתרבים (myogenic ובתאים), אשר בסופו של דבר להבדיל להשתלב myofibers הקיימים ו/או הפתיל טופס חדש myofibers2,3,4. הגילוי שלהם ואת ההתקדמות בחקר הביולוגיה שלהם הוביל תובנות משמעותיות שריר התפתחות והתחדשות.
פרוטוקולים לבודד, להבדיל myoblasts לתוך myotubes פותחו לפני שנים רבות, נמצאים בשימוש נרחב עדיין ללמוד שרירי השלד בידול5,6,7. עם זאת, רוב השיטות האלה מייצגים סטטי שגרות אשר מסתמכים על הניתוח של תאים קבוע, כתוצאה מכך, תאפשר למדענים לחקור תהליכים מאוד דינמי, כגון myoblast פיוז’ן וההתבגרות myofiber באופן מלא. הדוגמה הבולט ביותר היא מיקום הגרעין, אשר הוא, עם גרעינים בתחילה במרכז myofiber, והיא, לאחר מכן, הממוקמים בפריפריה אחרי myofiber ההבשלה8,9. הדמיה חיה היא הטכניקה המתאימה ביותר כדי להשיג עוד תובנות תופעה מוזרה שכזו.
כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת מדענים להקליט בידול myoblast היווצרות myotube על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות, כדי לבצע ניתוח כמותי החל מעקב אוטומטי של גרעינים myoblast. שיטה זו מספקת תפוקה גבוהה כמותיים אפיון של דינמיקה גרעיני והתנהגות myoblast במהלך התמיינות ופיוז’ן. הפרוטוקול מחולק לארבעה חלקים שונים, כלומר (1) אוסף של השרירים hindlimbs של עכברים, (2) בידודו של ראשי myoblasts המורכבת עיכול אנזימטי ועל מכניים, התפשטות (3) myoblast, בידול ו (4) חיים הדמיה כדי לעקוב אחר גרעינים בתוך ה 16 הראשונה של בידול myoblast.
בהליך הבא, myoblasts מבודד ויזת עבודה H2B-GFP עכברים, שטופלו µg 1/mL דוקסילין לזירוז ביטוי ויזת עבודה H2B-GFP, כפי שתואר קודם לכן10. לחלופין, זה אפשרי כדי לבודד את myoblasts של אחרים העכברים הטרנסגניים המבטאים החלבון הניאון בגרעין או כדי transfect את התאים מבודד פראי-סוג עכברים להביע את החלבון הניאון בגרעין, כפי שתואר על ידי פימנטל ואח. 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
סיבי השריר (myofibers) הם תאים multinucleated שנוצרו על ידי היתוך גרעיני של תאי שריר מבשרי (myoblasts) נגזר תאי גזע שריר (תאים הלוויין) עוברים התפשטות ובידול2,3, 4. כדי להעריך myoblast בידול, ההליך משותף מורכב culturing myoblasts המבדילים בינוני ותיקון התאים בנקודות זמן ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי AFM-מופע ההתרמה כדי E.V. (#21545) ועל ידי המענק זרע Ospedale סן רפאלה (OSR) כדי ש ז (ZAMBRA5X1000). ד ר ז’אן-איב Tinevez מהרכזת ניתוח תמונה של מכון פסטר הוא הודה לשיתוף פומבי הרגלים “פשוטה אירועי הכיבוי” MATLAB.
Materials
| chicken embryos extract | Seralab | CE-650-J | |
| collagenase | Sigma | C9263-1G | 125units/mg |
| collagen from calf skin | Sigma | C8919 | |
| dispase | Gibco | 17105-041 | 1.78 units/mg |
| doxyciclin | Sigma | D1515 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| fetal bovine serum | Life technologies | 10270106 | |
| gentamicin | Sigma | G1397 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050-098 | |
| Hoechst | life technologies | 33342 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | |
| penicillin-streptomycin | Sigma | P0781 | |
| red blood cells lysis medium | Biolegend | 420301 | |
| Digestion medium | |||
| collagenase | 40 mg | ||
| dispase | 70 mg | ||
| PBS | 20 ml | ||
| filtered 0.22um | |||
| Blocking medium | |||
| DMEM | |||
| Fetal bovine serum | 10% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| filtered 0.22um | |||
| proliferation medium | |||
| IMDM | |||
| Fetal bovine serum | 20% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 3% | ||
| filtered 0.22um | |||
| differentiation medium | |||
| IMDM | |||
| Horse serum | 2% | ||
| L-glutammine | 1% | ||
| penicillin-streptomycin | 1% | ||
| gentamicin | 1 ‰ | ||
| chichen embryo extract | 1% | ||
| filtered 0.22um |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89 (1), 81-88 (2000).
- Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224 (1), 7-16 (2010).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
- Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
- Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
- Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. , (2017).
- Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
- Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27 (1), 84-90 (2009).
- Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215 (1), 303-318 (2018).
- Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
- Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581 (16), 3076-3080 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
- . Simpel Tracker – File Exchange – MATLAB Central Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016)
- Burkard, R., Dell’Amico, M., Martello, S. . Assignment Problems, Revised Reprint. , (2009).
- Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), (2014).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
